Schemi di Biologia molecolare applicata

VITROCOLTURA IN VITRO DA 6 A 10 CELLULERIMUOVERE UNA SINGOLACELLULA DA CIASCUN EMBRIONEPROLIFERAZIONEESTRAZIONEDNAANALISI PER PCR

Per quanto riguarda la diagnosi delle malattie infettive si effettua una PCR negativa, in cui otterrò 0 molecole amplificate se non è presente il DNA del patogeno (quindi se non è presente l'infezione), che non viene amplificato.

Se ho una certa infezione, avrò per esempio la presenza di un batterio nel tratto urinario e quindi potrò recuperare dalle urine DNA del batterio. Estraggo tutto il DNA presente nelle urine, e se presente l'infezione questo DNA sarà contaminato dal DNA del patogeno. Questa diagnosi è possibile per qualsiasi microrganismo o virus di cui si conosce la sequenza del genoma ecco perché uso la PCR negativa.

Questo è un controllo positivo su gene umano, la coppia di primer deve sempre dare una banda.

-TEST HPV

Con la PCR si può anche

diagnosticare la presenza del papilloma virus. La PCR si può effettuare ocon primer aspecifici (presenti in ogni ceppo di HPV) per vedere se è presente o meno il virus (altaprobabilità), oppure con primer specifici per alcuni ceppi. Facendo ciò si tipizzano i virus in HR(high risk), MR e LR (non portano tumore).I ceppi patogeni possono disattivare p53, facendo già uno step per la formazione del tumore.Altri test commerciali più comuni, sono per Chlamydia (batterio endocellulare) dove il test viene fatto su DNA plasmidico perché più sensibile; per Mycobacterium tuberculosis (tipizzazione) e per HIV (carica virale con PCR quantitativa).

PCR IN DIAGNOSTICA TUMORALE

• Ricerca di mutazioni specifiche nel DNA delle cellule tumorali
• Valutazione del livello di espressione di mRNA di oncogeni o oncosoppressori mediante RT-PCR quantitativa

PCR MEDICINA FORENSE

• DNA SATELLITE
• DNA SATELLITE
• TRASPOSONI

Il DNA viene usato in genetica forense e

serve per identificare la persona che possiede un certo DNA. Molto spesso sono mutazioni in singola base che hanno una certa importanza dal punto di vista genetico. In maniera combinatoria si creano degli individui con un certo path. Si sono sviluppate altre metodiche per riconoscere un certo individuo sequenze altamente ripetitive (non sono rappresentate tantissimo come i trasposoni, sono al 5-10% del genoma che consideriamo). Sono sequenze fatte da poche cassette ripetute uguali una di seguito all'altra (agtagtagtagtagt). Sono altamente polimorfiche, ci sono cioè tantissime divisioni di queste sequenze. Sono altamente polimorfiche perché nelle generazioni ci sono stati meccanismi di crossing over ineguali. Nelle generazioni, in questi loci dei microsatelliti, ci sono fenomeni di crossing over ineguale. Abbiamo un polimorfismo che identifica un individuo perché va vedere nello specifico un certo DNA di individuo. Se operiamo una PCR con dei primer che riescono aqueste zone seportiamo poi su gel i prodotti, questisaranno diversi per PM e avranno diverse impronte genetiche il pattern generaletra questi prodotti sarà fondamentalmentediverso. Con queste sequenze si può anche fare analisi di parentela, perché se un individuobabbo o mamma ha circa la metà delle sequenze del DNA satellite del figlio, allora significa che tra quei dueindividui c'è parentela. Si può fare anche con parenti di secondo grado. I vaccini si basano sul principio di Pasteur (isola il germe, uccidilo e iniettalo). Si isolala tossina, si denatura o uccide il batteriocol calore o con solventi organici e questomateriale non più patogeno viene iniettatocol vaccino ricombinante della pertosse. Si fa qualcosa ancora di più preciso: con cambiamento di qualche aa si va adannullare la capacità enzimatica vaccino perfetto (iniettiamo la stessa

molecola totalmente inattiva). E' uguale il vaccino dell'epatite B. A volte questo non funziona, l'esempio più tipico è il vaccino per il meningococco. I biotecnologi cominciarono a cercare proteine che potessero essere prodotte e usate come vaccino contro il meningococco. In quel caso il problema era particolare. Sfuggire all'attenzione del sistema immunitario può voler dire esporre sulla superficie del batterio proteine del sistema immunitario per cui parte una risposta immunitaria blanda. Il batterio nei milioni di anni di coevoluzione ha imparato a capire quale sono le proteine che il sistema immunitario vede meno. L'approccio di Pasteur è prendere le proteine di superficie (le più abbondanti) -> si reverte il principio di Pasteur. La vaccinazione a DNA è usata soprattutto per vaccini antitumorali.

ONCOANTIGENI

VACCINAZIONE FATTA COL DNA

Un altro tipo di vaccinazione è quella diretta, fatta con DNA che codifica per una

proteina con potenzialità immunogene. È stato fatto per il virus del WNV, infezione dell'Africa: due proteine sulla superficie del virus molto importanti dal punto di vista immunogenico (E protein e M protein) sono state ricombinate e trasformate in vaccino. La difficoltà è che i vaccini devono essere mantenuti a temperature basse, ma l'idea fu: prendo i cDNA corrispondenti a queste sequenze delle due proteine e le inserisco in plasmide in cui vi sono promotori eucariotici a valle. Questi plasmidi vengono iniettati intramuscolo e i test hanno dimostrato che con questa iniezione una parte dei plasmidi entra nel nucleo delle cellule, sostenendo per un certo periodo di tempo la produzione di queste proteine, riversate nel circolo sanguigno, che producono immunità. La quantità di proteine prodotta è poca, ma in maniera costante per alcuni giorni, giusto il tempo per indurre risposta immunitaria. Così porto a giro il DNA, molecola moltopiù stabile di una proteina, che dà un minor numero di effetti collaterali sull'organismo (solo vsadiuvanti) e viene prodotto in maniera più semplice. È una tecnologia che però funziona peggio, delle volte fallisce: nonostante ciò potrebbe essere un vaccino interessante (vedi es. malaria che copre il 50%, ma almeno in parte la popolazione può essere coperta). Può essere utilizzato anche un diverso approccio: partiamo non dalla proteina, ma dal genoma!!!!
(REVERSE VACCINOLOGY)
 Faccio la sequenza del genoma del batterio
 a questo punto il bioinformatico cerca tutte le ORF (qualche migliaio) di almeno 70-80 codoni
 avrò tutte le proteine sintetizzate dal batterio
 tra queste, vediamo quali sono di membrana: quelle col dominio transmembrana, idrofobico e lungo 20-22 aminoacidi e in grado di poter fare un'alfa elica. Analisi a maglia larga: anche quelli di cui non si è sicuri, per non perderne quasi

nessuno

sono stati selezionati circa 400 potenziali proteine di membrana

deve essere analizzata ogni singola proteina, esprimendole banalmente: con PCR posso amplificare ognuno dei 400 geni che codificano per la proteina (cDNA), poi messa in vettore procariotico, espresso da E.Coli che produrrà le proteine

bisogna provare se queste possono essere dei vaccini, iniettandole in un ratto: ogni proteina sviluppa risposta immunitaria, ma questa è protettiva? Si isolano 5-6 protettive su 400

mettendole insieme, sono state usate come vaccino

Questo metodo è senza pregiudizio, parto dal genoma, evitando di prendere solo le proteine più abbondanti, ma tenendo in considerazione anche quelle poco espresse, per non escluderne nessuna.

A questo punto queste proteine selezionate, fanno partire una risposta immunitaria con produzione di anticorpi che, ad una successiva infezione, daranno memoria. (meningococco C).

VACCINO PER IL MENINGOCOCCO C Col meningococco si

può avere un approccio senza prevenzioni. Prendo e faccio l'intera sequenza del meningococco. In 6 mesi sequenziarono tutto il genoma del meningococco. A quel punto il bioinformatico cerca tutte le ORF, che erano qualche migliaio. Se si trova un ORF di 70-80 codoni si ipotizza che quella sequenza produca una proteina. Di conseguenza ho una collezione di tutte le proteine fatte dal batterio. Ci servono le proteine transmembrana, le quali hanno un dominio transmembrana (idrofobico, 20-22 aa e deve avere la possibilità di fare un α elica). In questo modo vennero selezionate 400 ORF, potenziali proteine di membrana. A questo punto, esprimendo queste proteine, si fa l'analisi di queste stesse. Una volta amplificata l'ORF in PCR, si mette poi in vettore di espressione e poi in Coliproteina. Furono iniettate singolarmente in un ratto in cui ognuna di queste proteine fa sviluppare una risposta immunitaria.. ma è protettiva? Alcune di queste (poche... vuol dire

Poche di queste (Laura) davano una risposta immunitaria protettiva, altre invece davano una risposta immunitaria non protettiva. Partendo dal genoma ho la stessa probabilità di produrre una proteina, non dipende dal genoma quanto prolifera e quanto è presente. Quando il sistema immunitario ha prodotto anticorpi contro quelle proteine allora è riuscito a produrre una risposta immunitaria.

VACCINO PER HPV contro il meningococco. Altro vaccino importante: HPV o virus del papilloma virus. È un virus che infetta a livello dell'utero. Se questa infezione è dovuta a ceppi comuni ad altro rischio (6,11,16 e 18), che dannoinfezione non grave ma, siccome si mantiene, nel tempo sono blandi virus oncogeni: come se le cellule attivate avessero avuto un'inattivazione degli oncosoppressori come p53 o Rb, di conseguenza possono essere viste come cellule oncogenichec'è una maggior probabilità di sviluppare tumore. Questo vaccino è simile come

impianto teorico a quello per l'epatite B (fatto ilColi veniva proteina monomerica, con monomeri tutti vicini tra loro). Ci sono due tipi di vaccino, entrambi fatti con tecnologia a DNA ricombinante:

• Vaccino quadrivalente (saccharomyces cerevisiae quadrivalente (costituito da VLPsdell'HPV 6, 11, 16, 18 prodotte da cellule di lievito (S. Cerevisiae) mediante tecnologia daDNA ricombinante)
• Vaccino bivalente (baculovirus costituito dalle VLps dell'HPV 16 e 18 prodotte consistema di espressione del Baculovirus mediante tecnologia di DNA ricombinante)

DNA VACCINATION

Vaccino trasportato a temperatura ambiente e che costa poco. Non necessita di uso di adiuvanti. Ilfatto che sia espresso ad esempio a livello del muscolo per una settimana, questo tende a dare unarisposta immunit