Biologia molecolare - schemi

Introduzione alla biologia molecolare

1953: Watson e Crick scoprono la struttura del DNA. Si cominciò di qui e si è arrivati fino alla formulazione dell'idea che tutte le malattie (eccetto i traumi) avessero una base genetica. Di qui è nato il progetto genoma: 1984-2004. Tuttavia, nonostante il sequenziamento del DNA, bisogna considerare che ognuno di noi ha un DNA diverso da quello di un altro. Sequenziato il DNA bisogna distinguere le sequenze codificanti e quelle che non lo sono. Inoltre, noi in parte siamo i nostri geni, ma molti di essi interagiscono con l'ambiente, così che noi diveniamo il nostro trascrittoma.

DNA, trascrittoma e proteoma

DNA: il genoma è l'insieme delle informazioni genetiche che caratterizzano un organismo. Tramite controllo trascrizionale si passa al trascrittoma che è l'insieme dei trascritti (codificanti e non) prodotti da una determinata popolazione cellulare: per ogni tipo cellulare diverso si hanno circa 10000 geni diversi. Infine, tramite controllo post-trascrizionale si arriva al proteoma, ovvero l'insieme delle proteine prodotte da una determinata popolazione cellulare.

Medicina molecolare

Medicina molecolare: è una branca della medicina che va a comprendere le basi molecolari delle malattie mono/poligeniche e multifattoriali. Essa porta a una diagnosi molecolare e quindi a terapie mirate e personalizzate (farmacogenomica). Si comprendono anche le differenze tra gli individui con le basi genetiche.

Biologia molecolare

Biologia molecolare: La biologia molecolare è la scienza che permette la comprensione delle basi molecolari della fisiologia e della patologia umana. Essa è lo studio della biochimica a livello molecolare. Va a studiare le interazioni tra genoma (DNA), trascrittoma (RNA) e proteoma (proteine). La comprensione di meccanismi molecolari che regolano le interazioni tra macromolecole e il loro significato biologico passa attraverso la caratterizzazione della loro struttura primaria e la capacità di manipolarla.

Bioinformatica

Bioinformatica: lo scopo di tale scienza è quello di definire l'insieme delle interazioni a partire da una cellula complessa che permetta di capire esattamente cosa succede a livello molecolare nella cellula viva in ogni sua fase.

Tecnologia del DNA ricombinante

DNA ricombinante e clonaggio

DNA ricombinante: grazie a questa tecnologia ci è possibile isolare i geni e averne abbastanza per ottenere dei cloni. Ovvero due molecole di DNA sono unite in provetta e fatte duplicare in laboratorio.

Clonaggio: in biologia vuol dire ottenere una popolazione di organismi geneticamente identici. In biologia molecolare clonare un tratto di DNA vuol dire avere una popolazione di molecole di DNA identiche alla molecola di partenza, base essenziale per poterlo manipolare e studiare. Nel clonaggio una molecola di DNA ricombinante viene generata, ovvero viene isolata dal suo contesto e introdotta in un replicone (un'unità di DNA capace di replicare varie volte detto vettore). Questo DNA ricombinante viene introdotto nel sistema cellulare appropriato (spesso batteri derivati da E. coli) ottenendo dei cloni batterici derivati da una singola cellula che ha inglobato un plasmide. Tutti i discendenti avranno tale molecola di DNA ricombinante, prima isolata, permettendo di produrne in un molto ampio numero.

Plasmidi

Plasmidi: uno dei vettori più usati, che sono molecole già presenti in natura, extra-cromosomiali di DNA circolare che si replicano e segregano autonomamente rispetto al DNA cromosomale batterico. Sono presenti in natura in stato di parassiti o simbionti con la cellula ospite. Sono portatori di geni che danno vantaggi selettivi alla cellula (uno dei più importanti è la resistenza agli antibiotici). Possono ospitare DNA esterno e sono facilmente purificabili dal DNA cromosomale del batterio. Caratteristiche essenziali: devono avere la loro origine di replicazione (infatti non si replicano con il DNA batterico); hanno bisogno del marcatore di selezione che permetta ai batteri trasformati di crescere su un terreno selettivo (quelli senza il DNA ricombinante muoiono quando sono messi su un terreno con antibiotico); hanno una regione adatta a inserire il DNA da clonare (sito multiplo di clonaggio/MCS/polylinker) che è diversa sia dall'origine sia dalla regione che porta la resistenza all'antibiotico.

Inserimento del DNA estraneo e digestione

Inserimento DNA estraneo: si sfruttano gli enzimi di restrizione o endonucleasi: questi tagliano la doppia elica di DNA in corrispondenza di sequenze specifiche. Nel 1970 Hamilton Smith ha isolato il primo enzima che taglia il DNA a livello di una sequenza nucleotidica specifica, ovvero EcoR1 (G|AATTC e CTTAA|G sul secondo filamento). In questo modo si formano delle estremità sticky che sporgono sul 5'. Se le vi è metilazione di tali nucleotidi, EcoR1 non si lega: la metilazione è una tecnica di protezione. Gli enzimi di restrizione proteggono i batteri dall'introduzione di molecole di DNA esogeno. Sono stati isolati più di 1200 enzimi che tagliano il DNA in modo preciso e prevedibile, riconoscendo ben 130 sequenze nucleotidiche diverse (sono sempre sequenze palindrome di 4, 6 o 8 nucleotidi). Il taglio può dare delle estremità diverse:

• EcoR1 dà protruding (filamenti sporgenti al 5')
• EcoRV dà estremità blunt (taglia esattamente a metà)
• Pst1 dà protruding (filamenti sporgenti al 3')

Per gli enzimi che riconoscono sequenze di 4 in media si avrà un taglio ogni 256 nucleotidi (4⁴), se sono 6 allora ogni 4096 (4⁶). Spesso si sfruttano più endonucleasi. Le estremità coesive prodotte da uno stesso enzima possono appaiarsi: in più oltre alla coesione, serve la DNA ligasi che sfruttando un P della ATP forma tra le basi dei legami covalenti. La ligasi infatti catalizza la formazione di legami fosfodiesterici.

Estremità blunt e digestione del DNA

Estremità blunt: le estremità nette prodotte da un enzima possono essere legate ad altre estremità nette prodotte da qualsiasi altro enzima, senza le limitazioni imposte dalla complementarietà delle basi delle code appiccicose. Ma si hanno degli svantaggi: una ligasi di estremità blunt è meno efficiente perché non si ha appaiamento tra code a singolo filamento e perché la sequenza ibrida che si forma non è riconosciuta da nessuno dei due enzimi (quelli che hanno operato il taglio dando due blunt diverse).

Digestione DNA: il DNA con gli enzimi di restrizione può essere analizzato tramite elettroforesi. Sfruttando un gel di agarosio che ha delle particelle di dimensioni caratteristiche (il tutto dipende dalla concentrazione del gel), si creano dei pori (più piccoli maggiore è la concentrazione). Inserite le molecole di DNA in questa mistura (dal polo negativo) e applicato un campo elettrico, il DNA tenderà a muoversi verso il polo positivo facendosi strada attraverso i pori. (Il tempo dipenderà dalla concentrazione del gel). In questo modo si otterranno due bande diverse: una di DNA batterico e una riferita all'inserto. La divisione avviene in base al peso molecolare.

Trasformazione e processo di inserimento

Trasformazione: Si ha così una molecola di plasmide ricombinante, ricircolarizzato con il DNA esogeno inglobato. Per analizzarli serve amplificare: si trasformano le cellule di E. coli (se si inserisce DNA esogeno in batteri si parla di trasformazione, nelle cellule eucariotiche di transfezione, mentre infezione se il vettore è un virus), batteri di tipo gram-negativo. Per trasformazione si fanno dei pori nei batteri incubandoli in una soluzione di calcio-cloruro e sono mischiati così con il DNA plasmidico.

Processo di inserimento: In alcuni batteri il DNA ricombinante entrerà e in altri no. Per questo, data la resistenza a degli antibiotici, tutti i batteri non trasformati moriranno se messi a contatto con tale antibiotico. I plasmidi nella cellula si moltiplicano/duplicano nel batterio iniziale e si producono generazioni filiali finché non si ha una popolazione clonale che forma una colonia batterica che porta ad un clone batterico. Si hanno così numerose copie del DNA ricombinante. I cloni vengono poi aggiunti in una soluzione che rompe la membrana batterica: esce il DNA plasmidico e cromosomale, poi attraverso centrifuga i plasmidi che sono più leggeri li si ritroverà più in alto e saranno così estratti con maggior facilità.

Efficienza di clonaggio

È possibile migliorare l'efficienza del clonaggio. Il plasmide dopo endonucleasi potrebbe richiudersi su se stesso, appaiandosi (situazione favorita dalla molecola di DNA). Per migliorare l'efficienza si hanno vari modi:

• Si usano un numero di molecole di inserto maggiore di quelle del plasmide (3:1-5:1)
• Si usano frammenti generati con più di un enzima di restrizione sia nel plasmide sia nel DNA esogeno così che il plasmide non possa richiudersi su se stesso (estremità non compatibili) e lo si possa inserire anche con una direzionalità
• Si usa una molecola di plasmide legata con l'inserto che ha un legame fosfodiesterico con la catena: il plasmide va incontro a replicazione anche se c'è solo un legame fosfodiesterico su uno dei due filamenti; ovvero: da uno dei filamenti del vettore (al 3' OH-P e al 5' P-OH) tolgo un fosfato con fosfatasi e si sfrutta un inserto che ha un fosfato su quel filamento che porta a formare un legame (il tutto è riparato con il sistema di riparazione)
• Un altro metodo per migliorare l'efficienza: in una ligazione è importante sempre trovare dove si ha davvero ricombinazione; ecco perché nei plasmidi spesso si inserisce l'enzima che codifica per Lac-Z (produce beta-galattosidasi) che colora i suoi substrati di colore blu. Le colonie così modificate avranno colore blu. I batteri con DNA esogeno avranno colonie bianche perché il polylinker dei plasmidi blocca il Lac-Z. Quelle che interessano sono le colonie bianche.

Caratteristiche dei vettori plasmidici

Sono piccoli e trasformano bene i batteri, sono prodotti in alto numero, molto versatili e facili da usare. Hanno degli ostacoli/svantaggi: la trasformazione dei batteri ha efficienza relativamente bassa ed è bassa la densità a cui crescere le colonie (le colonie si inibiscono a vicenda e diventano così molto piccole); hanno una limitata quantità di contenuto di DNA esogeno (solitamente 3000 coppie di basi e a fatica un massimo di 14000 basi).

Vettori fagici

Un altro vettore molto usato (per secondo nella storia) è un altro derivato di microrganismi, batteriofagi lambda, molto usati per analizzare librerie genomiche o cDNA. È un fago e ha DNA all'interno di una testa fatta di proteine, ha un collare e una coda di fibre. Il DNA deve essere iniettato tramite un ago, passando attraverso il collo del fago. Si infettano sempre batteri di E. coli. Il fago infetta il batterio e ne causa la lisi. Si fa una piastra di soft-agar (più diluito di quello dei plasmidi) dove quelli non infettati crescono dando un tappeto di cellule, mentre quelle infettate verranno lisate via via a catena, ottenendo così una placca di lisi. Si può prelevare questa placca, metterla in un tappeto di coltura e far infettare altri batteri così che tutti siano infettati dallo stesso fago. Si hanno così grandi quantità di fago da cui purificare il DNA modificato. I vettori fagici hanno gli stessi svantaggi dei plasmidi, ma sono più efficienti di quelli plasmidici (si hanno molti più batteri infettati così).

Ciclo del fago

Assorbito dall'E. coli, inietta il DNA nel batterio, che gli permette di esprimere le proteine virali sfruttando l'apparato di trascrizione del batterio (subito prodotte le proteine precoci per replicare il DNA virale e poi si hanno le proteine strutturali per formare la particella infettiva) e le particelle fagiche così formate vengono rilasciate per infettare altri batteri. Il DNA fagico ha alcune sequenze essenziali, ma altre regioni non richieste per il ciclo vitale: a noi basta che lisi il batterio, si replichi e produca molto DNA ricombinante. Si possono eliminare le regioni non indispensabili nel ciclo vitale. Il loro DNA ha due bracci che possono essere ligate con del DNA esogeno. Se si clonano frammenti troppo piccoli questi non si impaccheranno. Dal DNA nudo si deve passare alla particella virale infettiva: si fanno estratti dai batteri e si hanno anche le proteine strutturali che portano al packaging in vitro (ricostruzione in vitro di una particella virale con capacità infettiva a partire da una preparazione di teste e code del fago lambda in presenza di molecole di DNA ricombinante costruite sulla base del DNA virale oppure di un cosmide. L'infezione di cellule di Escherichia coli a opera di particelle virali ricostruite è utile al fine di inserire nelle cellule batteriche molecole di DNA ricombinante. Introduzione di un vettore ricombinato fagico o cosmidico in un capside virale ricostituito in provetta a partire dalle proteine costitutive).

Altri vettori

Per avere inserti più lunghi servono dei vettori diversi anche concettualmente. Non esistono in natura dei batteri che possano portare dei DNA così grossi. Il problema è come replicare efficientemente. Si sono generati artificialmente dei cromosomi batterici artificiali (BAC): si replicano autonomamente allo stesso modo dei cromosomi batterici (cellule batteriche con un cromosoma artificiale e uno batterico; poche copie, ma replicazione efficace senza rotture e si hanno frammenti anche maggiori di 300 kb). Vi sono poi i PAC poco usati (derivano dal fago PI e vanno fino a 100 kb). Infine gli YAC (cromosomi artificiali di lievito fino a 2 Mb: hanno un modo di crescere manipolato simile ai batteri). I vettori plasmidici vanno da 0 a 10 kb, i lambda di inserzione fino a 10, quelli di sostituzione da 9 a 23 kb. YAC è un cromosoma artificiale di lievito: ha quindi il centromero, i telomeri e una o più origini di replicazione; ha poi URA3 (crescono anche dove non c'è uracile) e poi una zona con sito di clonaggio nel vettore. Si digerisce parzialmente il DNA bersaglio con EcoRI e il vettore YAC con EcoRI e BamHI; poi si separano i due bracci; poi si ligano vettore YAC e inserto e infine si trasformano le cellule di lievito, selezionando per i 2 marcatori diversi posizionati ciascuno su un braccio diverso.

Come si clona il genoma

Si generano genoteche o librerie di DNA, ovvero una collezione completa di frammenti di DNA, inseriti singolarmente in un vettore di clonaggio. Può essere DNA genomico (libreria genomica) o cDNA (libreria trascrittoma).

Libreria genomica

Libreria genomica: collezione di cloni che include tutto il DNA genomico di una specie (si spezza il DNA in frammenti e ognuno clonato in vettori che anche se sono spezzati e diversi, tutti insieme costituiscono il genoma intero). Per costruirla si usa enzima di digestione, si inserisce in un vettore, si hanno molecole di DNA ricombinante e si infettano i batteri dove ogni batterio contiene un frammento del genoma (si ha così una libreria genomica). A noi servono grandi frammenti, non tutti uguali e quindi ci servono frammenti che si sovrappongano, che permettano di darci la continuità e la possibilità di inserire i frammenti nell'ordine giusto: si fanno quindi delle digestioni parziali. Ovvero: Le digestioni parziali di un genoma garantiscono la produzione di una collezione di cloni sovrapposti. Una popolazione di inserti parzialmente sovrapposti tra loro, è essenziale per le procedure di chromosome walking necessarie nei progetti di sequenziamento e nello screening di geni e permette anche di aumentare la rappresentatività della libreria. Si può costruire la libreria genomica dell'uomo con il fago lambda: si possono avere frammenti troppo grossi e allora si usa un endonucleasi che taglia ogni 4 nucleotidi (Sau3A), ovvero frequentemente. Le estremità appiccicose generate dalle endonucleasi: Sau3A Si ha una parziale digestione del DNA umano riconosce GATC e con Sau3A, così da ottenere frammenti con BamH1 riconosce G- estremità sticky. Si ha taglio poi anche del DNA del fago con BamH1 ottenendo due bracci sticky (le estremità sticky prodotte dai due enzimi sono compatibili). Uniti tramite ligasi, si ha packaging. Digerito il genomico con Sau3A con frammenti eterogenei di 20kb che si sovrappongono, mentre il DNA del fago si ha tramite digestione con BamH1: le estremità prodotte dai due sono compatibili senza problemi.

Libreria a cDNA

Libreria a cDNA: Il DNA contiene anche delle sequenze codificanti e per questo è necessario partire da molecole di mRNA matura. Si parla quindi di libreria a cDNA che è una collezione dei cloni che include tutte le specie si mRNA espresse in un dati tessuto. Se per ogni organismo vi è una libreria genomica diversa, per ogni organismo si hanno messaggeri diversi a seconda del tessuto. Dalla sequenza dei cloni si può derivare la sequenza della proteina codificata. Ogni libreria contiene solo quelle specie di mRNA (trascritte in cDNA) che sono espresse in un dato tessuto e in una data condizione. Gli RNA codificanti sono solo il 2% di quelli totali e per questo serve purificare mRNA a partire dagli altri tipi di RNA, cominciando dalla coda di poliA. Si genera una coda di oligonucleotidi con sequenze di T. Questi vengono poi mischiati con RNA totale e tRNA e rRNA non hanno affinità per gli oligo-dT mentre ce l'hanno gli mRNA. Gli RNA non legati vengono tagliati via e a questo punto la soluzione con mRNA e oligo-T viene inserita in una soluzione con poco sale fino al distacco degli oligo-dT.

Da mRNA a cDNA

Perché ciò avvenga è necessario il processo di trascrittasi inversa che trascrive DNA a partire da molecole di RNA. Processo molto usato da...