Biologia molecolare - schemi

SPLICING

Splicing: le sequenze di riconoscimento per lo splicing si compongono di sito di

riconoscimento al 5' che inizia con GU (nell'esone) e nell'introne AG. Si ha poi

anche il branch point nell'introne che è un altro punto di riconoscimento

caratterizzato da una A di solito vicino alla sua estremità 3' ed è seguita da un

segmento di polipirimidine. Una A, peculiare poiché si ritrova dentro l'introne,

mediante il suo ossidrile in C2, attacca il gruppo fosfato di giunzione tra la G

dell'introne ed il resto dell'esone a monte. In questo modo si forma una catena

corta di pre-RNA che si chiude su stessa e rimane legata all'esone a valle. Una

seconda trans-esterificazione tra l'ossidrile libero dell'esone a monte ed il fosfato

di giunzione dell'esone a valle che lega il lariat, ovvero la formazione a “laccio”

precedentemente costituita, unisce i due esoni. A questo punto lo splicing è stato

compiuto e l'estremità intronica, che mantiene la caratteristica struttura lariat, è

allontanata. Si ha quindi un ripiegamento intorno ad A.

Spliceosoma: non ci sono proteine di splicing, ma per avvenire in modo efficiente

serve lo spliceosoma. Non è un'unica entità ma è formato da vari elementi. Vi

sono proteine e piccoli RNA, gli snRNP che hanno una porzione di RNA

complessata a particolari proteine. Il primo evento di splicing è che la U1 di un

snRNP riconosce il sito di splicing a 5' e la U2 snRNP riconosce la A del sito di

branching. Questo fa cambiare la sequenza, si recluta allora un altro snRNP e

intervengono gli altri che circolarizzano e fanno contattare la A con il 5'. Poi

interviene U6 che aiuta la transesterificazione

Esempi di fenomeni biologici fondamentali resi possibili dal

controllo combinatoriale dell'espressione genica

Lo sviluppo del piano corporeo in drosophila: alcuni geni regolano complessi

programmi di sviluppo. Molti geni sono conservati tra questo insetto e i

mammiferi: i geni dei mammiferi però si sono evoluti, ma i meccanismi della

drosophila sono mantenuti. Ha testa, torace e addome e ciascuno di questi

segmenti ha regioni specializzate: nella testa occhio e antenna, nel torace tre

segmenti (T1,2 e 3: in T1 si sviluppa una zampa, in T2 una zampa e un'ala, in T3

un'altera che serve a stabilizzare il volo) e nell'addome 8-9 segmenti specializzati.

Lo sviluppo dalla cellula uovo deve portare a questa specifica segmentazione.

Geni master: tali geni regolano da soli complessi programmi di sviluppo e se sono

compromessi cambia lo sviluppo. Per esempio, il mutante antennapidia ha piedi al

posto delle antenne: la mutazione che regola tale fenotipo era proprio nel gene

detto antennapidia (è mutata la zona regolatrice). Mutando la regione regolatrice

che si esprime solo nella regione del torace, ora tale gene si esprime anche nella

testa e questo provoca tale mutazione. L'informazione c'è dappertutto per dare

l'antenna: basta cambiare il modo di regolare un gene per dar luogo allo

svolgimento di un programma di sviluppo in un luogo sbagliato. Si è visto che vi

sono gruppi di cellule nella larva già specializzate e con un destino. La zona che dà

origine alla testa ha un gruppo di cellule il cui destino è dare origine all'occhio

adulto. Nel torace un gruppo origina la zampa. Se noi prendiamo il gene master

per l'occhio detto gene ey e lo sostituiamo mettendolo dove c'è la zampa: la

zampa si esprime, ma sulla zampa si ha un occhio. Basta avere un gene master e

spostarlo, cambiare la sua espressione e determinare un complesso piano di

sviluppo che porta alla mutazione.

Sviluppo embrionale Drosophila: ovocita e poi si ha sviluppo embrionale e larvale

negli insetti. Lo sviluppo embrionale deve essere corretto e avviene in un giorno:

dopo 24 ore si ha la schiusa della larva e poi si hanno tre stadi. Dopo 5 giorni si

ha la pupa nel bozzolo e poi l'insetto adulto. Già nell'embrione ci sono i destini

delle cellule e già lì si ha la programmazione delle cellule. Da una singola cellula si

passa a molte altre cellule dove si sono già determinate le regioni. Da 5 a 8 ore

questa struttura porta a specializzarsi. Poi segmentazione e dopo 10 ore si hanno

i segmenti tutti divisi. La prima fase è il blastoderma cellulare che dura due ore

dove l'embrione non si ingrandisce. All'inizio si hanno nove divisioni dei nuclei e

per cui si forma una cellula multi-nucleata che è il sincizio. Poi i nuclei prima

distribuiti ovunque, migrano verso la superficie dove ci sono tutti i nuclei e resta

il citoplasma vuoto. Si ha ora un blastoderma sinciziale, dove non si ha ancora

divisione tra le cellule ma si vede già la regione posteriore dove le cellule si

mantengono indifferenziate e sono responsabili delle germinali. Dopo quattro

divisioni ulteriori si ha il blastoderma cellulare dove tutto l'embrione è circondato

da una specie di pelle e una volta che si sono formate così il destino è quasi

segnato del tutto. Si possono osservare le colorazioni a strisce con il gene Eve

(grigio) e Fushi-tarazu (marrone) che portano a formare i segmenti. Dopo 2,7 ore

si ha una suddivisione in po' sfuocata; dopo 3,5 la suddivisione è molto

determinata e di uno spessore per striscia di 2 cellule.

Formazione strisce e determinazione degli assi: nello sviluppo iniziale

dell'embrione si può notare come gli assi principali sono stati definiti già

nell'ovocita. Si hanno cellule specializzate, quelle a contatto diretto con l'ovocita,

quelle del follicolo che danno un segnale terminale determinando il polo

posteriore e quello anteriore. Poi vi sono altre cellule del follicolo che forniscono

segnali ventrali. Già determinati quindi assi dorso-ventrale e antero-posteriore. Il

tutto è iniziato dai geni della polarità dell'uovo: sono geni espressi a livello di

RNA nelle cellule del follicolo, quindi materne e l'RNA trasportato nell'ovocita è

ancorato in posizione anteriore o posteriore a seconda dell'ovocita. Questa può

essere una mutazione ad effetto materno. Le cellule del follicolo che danno

segnale posteriore fanno attaccare gli RNA e codificano per Nanos, un gene che

serve per regolare le proteine. L'mRNA viene trasportato nell'ovocita e ancorato.

All'inizio non si hanno divisioni cellulari, ma si ha un unico sincizio. Qualsiasi

proteina è in grado di diffondere. L'mRNA localizzato in Nanos fa dare un

gradiente di concentrazione: massima al polo posteriore dove la proteina è

sintetizzata e minima dall'altro lato. Stessa cosa in Bicoid: l'mRNA per tale

proteina si lega nella parte anteriore dove si ha la sua sintesi ed essa diffonde

dando di nuovo un gradiente. La sintesi della proteina è localizzata poiché

l'mRNA è localizzato. Le cellule possono localizzare determinati mRNA. In una

cellula la sintesi di mRNA porta ad avere la massima concentrazione della

proteina in quella regione e perciò se non ci sono meccanismi che eliminino la

proteina si ha gradiente. Formato il gradiente si hanno i confini cellulari. Si ha un

sistema anche terminale e dorso-ventrale. Per determinare questo asse e dove

finisce, tutto dipende da cellule di nuovo

specializzate a contatto con il follicolo. Il

sistema terminale è dato dalla

localizzazione specifica di alcuni recettori

che sono attivati solo in determinate

regioni e determinano il confine tra i

foglietti embrionali (ectoderma...) e

l'orientamento dorso-ventrale. Le cellule

del follicolo stimolano i recettori e per

contatto cellula-cellula attivano i recettori

solo in specifiche zone, creando un

gradiente. Tutti questi segnali agiscono regolando l'espressione di geni specifici nel

nucleo del blastoderma, dando un programma specifico.

Geni di segmentazione: sono usati per regolare l'espressione.

- i primi sono quelli di origine materna, con mRNA legati a zona anteriore e

posteriore che sono detti polari.

- poi i geni GAP che sono sei e sono richiesti in ampie regioni lungo l'asse antero-

posteriore e sono Krüppel e Hunchback. Le mutazioni eliminano gruppi di

segmenti adiacenti.

- poi vi sono 8 geni della regolazione della coppia richiesti per lo sviluppo di

segmenti alternati del corpo. Mutazioni colpiscono segmenti alternati: Eve per

esempio fa saltare i segmenti pari.

- la corretta espressione dei geni della coppia fa avere i segmenti alternati e

determina l'espressione dei geni della polarità segmentale. Tutti insieme aiutano

l'espressione dei geni omeotici che determinano le differenze tra le varie zone e

la formazione di alcune parti. I geni omeotici si hanno anche nei mammiferi e

danno luogo alle strutture specializzate dei vari segmenti.

Meccanismo di Eve: Meccanismi analoghi si hanno in tutti gli altri. La regolazione

in segmenti avviene grazie alla combinazione di due elementi: da un parte il fatto

che Eve ha una regolazione complessa ed è modulare. La modularità si combina

con il gradiente di concentrazione. Bicoid viene espressa solo al polo anteriore e

avviene anche per Hunchback nella parte anteriore. Si ha produzione poi

localizzata in grandi regioni dei geni GAP come Giant e Krüppel (repressori). La

loro concentrazione è diversa nelle zone diverse dell'embrione. Gradienti ed

espressione localizzata specifica e combinazione di attivatori e repressori

interagiscono con le regioni di controllo del gene Eve. Eve ha elementi che ne

controllano la trascrizione a valle e a monte. A monte della tata box si hanno tre

moduli diversi. Uno responsabile per Eve nella striscia 7, uno in striscia 2. La

conferma che l'espressione in 2 è determinata solo da quel modulo è data dal

fatto che i ricercatori hanno preso tale regione e con un plasmide ricombinante

hanno inserito la beta galattosidasi nella regione regolatoria della striscia 2.

Hanno visto tale striscia colorarsi di blu e quindi hanno capito che quel modulo è

necessario e sufficiente per far esprimere Eve nella striscia due. Il modulo della

striscia 2 ha siti di legame per fattori di trascrizione. Vi sono 6 siti per Bicoid

(attivatore trascrizionale), di cui due siti sono solo per Bicoid mentre gli altri

possono sovrapporre altri fattori: Giant e Krüppel (repressori). Si lega Bicoid solo

quando è più affine e più concentrato del repressore. I repressori hanno la

funzione di ostacolare l'attacco degli attivatori. Questa vale anche per l'attivatore

Hunchback che ha solo un sito e si attacca dove si lega anche Giant. I repressori

hanno a loro volta siti di legame unici, non in comune con gli attivatori. La striscia

due si forma alla fine dell'espressione di Giant. Quando questo arriva quasi a zero

il modulo della striscia