Schemi Biologia cellulare e molecolare

ORGANELLI E SMISTAMENTO DELLE PROTEINE

• cellula eucariota --> complessa, organizzata --> organelli (set enzimi\proteine

specializzate)

• proteine vanno veicolate --> ca 10 miliardi di 10 mila tipi diveri

• cellula: nucleo + citoplasma (cytosol + organelli)

• organelli (info strutturali importanti non si possono costruire da novo):

1. reticono endoplasmatico (ER)

2. golgi

3. lisosomi e endosomi

4. perossisomi

5. mitocondi e cloroplasti

• perchè organelli?

1. Specializzazione

2. aumento della superficie in cui avvengono reazioni di membrana

• origine evolutiva? Invaginazione membrana plasmetica (introflessioni --> es. ER) +

endosimbiosi

• 3 compartimenti topologici

1. citosol e nucleo

2. organelli via secretoria (ER, golgi, liso, endo) --> si scambiano materiale

(vescicole)

3. mitocondi e cloroplasti

• 3 tipi di trasporto:

1. trasporto regolato: tra 2 zone topologicamente uguali

2. transmembrana\traslocazione: tra 2 zone diverse

3. vescicolare: tra zone uguali --> vescicole

• i segnali di sorting sono nella sequenza amminoacidica della proteina

nucleo

• il trasporto avviene attraverso gli NPC (3000- 4000 in una cellula di mammifero)

• NPC = complessi dei pori nucleari (canali acquosi) --> + di 30 nucleoporine diverse

• Regioni non strutturate delle nucleoporine bloccano il passaggio

Dimensione (kDa) Come attreversano NPC

Fino a 5 Passa liberamente

Fino a 17 Ca 2 min

Fino a 44 Ca 30 min

Oltre a 60 Non passano

--> NLS: segali di localizzazione nucleare

• sequenze segnale ---> 4-5 amminoacidi carichi + ---> importine

• importine: ricososcono segnale, proteine citosoliche solubili --> si legano alle fibrille

dei NPC (FG ripetute) --> non hanno direzionalità saltano sulle fibrille

• direzionalità = enzima Ran-GTPasi

---> NES: seganle di esportazione nucleare

• 4 amminoacidi idrofobici in qualunque parte della sequenza

• esportine

Ran-GTPasi

• direzionalità

• Ran-GAP:citosol --> da GTP a GDP

• Ran-GEF: nucleo --> da GDP a GTP

• importina + proteina --> saltella sulle fibrille --> entra nel nucleo --> Ran-GEF lega

Ran-GTP all'importina che rilascia la proteina --> importina+Ran-GTP esce e Ran-

GAP idrolizza Ran-GTP a Ran-GDP e l'importina

viene rilasciata

• esportina: entra nel nucleo e Ran-GEF attacca

Ran-GTP --> questo permette di legare la

proteina (cargo) --> esce Ran-GAP idrolizza la

GTP e l'esportina rilascia il cargo

proteine navette

• NLS + NES

1. tutti e 2 funzionano --> la concentrazione della proteina dipende dalla

velocità di import-export

2. funzionano in momenti diversi --> più frequente

• trasporto dal\al nucleo è regolato --> legami con altre proteine o fosoforilazione

---> export RNA

• miRNA, tRNA, rRNA --> esportine + GTPasi

• mRNA + fattori di export nucleari (co-trasc) = mRNPs --> GTPasi + ATPasi

mitocondri

• trsclocazione

• diverse destinazioni --> diversi traslocatori

1. TOM

2. TIM 22, TIM 23

3. SAM ----> complessi intermembrana

4. OXA

5. (MIA -->fattore)

• post-traduzionale

• segnale --> N-terminale: 1 amminoacido carico + (lisina, arginina) ogni 3-4

amminoacidi --> alfa elica con quelli carichi tutti da una parte

• solo import, export solo come segnale di apoptosi

--> matrice

• TOM (m esterna) + TIM23 (m interna) --> la proteina passa prima da TOM e subito

si infila in TIM

• Hsp70 citosoliche --> evitano ripiegamento sbagliato

• Hsp60 mitocondriali --> ripiegano la proteina

• proteina ripiegata --> peptidasi toglie il segnale

• costo energetico:

1. chaperoni si staccano per permettere inserimento in TOM --> idrolisi ATP

2. entrare in TIM23 --> potenziale di membrana --> segnale è carico + spinto

dal gradiente

3. Hsp 60 tirano la proteina --> idrolisi ATP

--> membrana esterna

• TOM + SAM

• proteina entra nello spazio intermembrana (TOM)

• chaperoni intermembrana legano la proteina e la portano a SAM

• SAM: inserisce e ripiega le proteine nella membrana (simile a BAM nei procarioti

--> endosimbiosi)

---> membrana interna

• tre modi diversi

1 TOM + TIM23

• = a matrice

• c'è un secondo segnale --> STOP blocca proteina dentro a TIM23, peptidasi toglie il

primo segnale

• la proteina è traslocata --> rimane associata alla m interna

2 TOM + TIM23 + OXA

• = a matrice

• il secondo segnale non blocca la proteina dentro TIM23 ma è una sequenza

riconosciuta da OXA che reinserisce la proteina nella membrana

• primo segnale è tagliato

• OXA di solito si occupa delle proteine mitocondriali

3 TOM + TIM22

• no Hsp70 mitocondriali

• proteina entra in TOM --> spazio intermembrana

• proteina portata a TIM22 che la inserisce nella m interna ---> no sequenza è

energeticamente favorevole --> domini che di solito stanno dentro la membrana

• usato per trasportatori e canali multipassaggio

---> spazio intermembrana

• 2 modi

1 TOM + TIM23 + peptidasi

• entra da TOM

• TIM segnale di stop --> peptidasi nella matrice taglia il primo segnale

• peptidasi nello spazio intermembrana taglia il segnale di stop

• proteina viene rilasciata

2 TOM + MIA

• entra da TOM (1 solo segnale)

• il fattori MIA40 crea ponti di solfuro tra le cisteine tirando la proteina che esce da

TOM

perossisomi

• usano ossigeno molecolare per rimuovere atomi H da substati specifici --> produce

acqua ossigenata

• acqua ossigenata è usata per detossificare molecole tossiche, quando è in eccesso

la catalisi la converte in acqua

• demolisce acidi grassi --> β-ossidazione --> li converte in acetilCoA

• ciclo del gliossilato (zuccheri+ lipidi)

• biosintesi dei lipidi --> lipidi della guaina mielinica

• organelli diversificati anche in vari tipi cellulari di un organismo

---> trasporto

• sequenza di 3 amminoacidi specifica su le proteine = sequenza di importazione -->

serina + lisina + leucina a C-terminale

• perossine (almeno 23 proteine): coinvolte nell'importazione, che è spinta dall'idrolisi

dell'ATP --> le proteine non necessitano di unfolding

• prendono cio che gli serve dall' ER (lipidi, proteine di membrana) e dal citosol

(enzimi di matrice)

• si moltiplicano per accrescimento (inglobano le vescicole) e fissione

reticolo endoplasmatico

• ER

• george E Palade (nobel 1974) --> inserisce in una cellula del pancreas degli

amminoacidi radioattivi per 3 min --> si producono proteine marcate ---> dopo 3min

la > parte delle proteine è nell'ER, dopo golgi e vie secretorie

• via secretoria --> ER, golgi, altri organelli o matrice extracellulare --> collegata

all'endocitosi

• funzioni ER --> produzione proteine secretorie (ripiega, modifica, assembla,

controllo qualità) e membrane per gli altri organelli (fosfolipidi), conserva il calcio

• fosfolipidi: fosfatidilcolina e colesterolo sulla membrana esterna --> poi flippati

all'interno per essere spediti

• ER: tubi (liscio: sintetizza lipidi, deposito Ca) + cisterne (ruvido: proteine) --> >50%

membrane e -10%del volume

ER ruvido

• è il più abbondante

• sintetizza e matura le proteine

---> traslocazione delle proteine

• esperimento di Babel

• segnale:regione polare carica (taglio qui) + 7-15 amminoacidi idrofobici + regione

polare non carica

• il segnale è eterogeneo: è all'N-terminale per le proteine solubili e in mezzo per

quelle transmembrana

• perchè è cotraduzionale?

1. ER = esterno cellula --> citosol ha caratteristiche diverse --> se un proteine

dell'ER si ripiega nel citosol si ripiega male

• ER il solo punto d'entrata --> controllo qualità, determina orientamento delle

proteine

• SRP: riconosce il segnale appena viene sitetizzato dal ribosoma --> si lega alla

sequenza segnale e al ribosoma (blocca traduzione)

• SRP: formato da 6 catene polipeptidiche

• l'SRP porta tutto all'ER dove c'è un recettore che lo riconosce --> il ribosoma viene

attaccato al canale di traslocazione e l'SRP viene rilasciato

• canale di traslocazione = Sec61

3 subunità: α, β, γ

1.

2. α è la più grande --> forma un anello con una alfa elica che sporge fungendo

da tappo e si può aprire anche lateralmente

3. diventa impermeabile quando ci si siede sopra il ribosoma

• proteina solubile --> entra nell'ER, viene traslocata lateralmente (s segnale è nella

membrana) --> peptidasi tagla il segnale e rilascia la proteina (altra peptidasi taglia

il segnale per dividerlo e farlo degradare)

• transmembrana:2 segnali --> il primo è uguale a psolubile + secondo segnale è di

stop

• segnale di stop --> quando entra nel traslocatore stoppa la traduzione, la proteina si

spostaz lateralmente, il ribosoma si stacca e finisce di tradurre

1. tipo 1: N-terminale nel lume (un passaggio) --> segnale idrofobico rimane

nella membrana

2. tipo 2: C-terminale nel lume --> parte carica non passa entra la parte prima

del segnale

3. tipo 3: N-terminale nel lume --> viene inserita come il tipo "

4. multipassaggio: strat in mezzo la proteina entra fino allo stop --> sequenze

start e stop ripetute

• traslocazione post-traduzionale --> traslocone + Sec 62, 63, 71, 72 + BIP

(chaperone molecolare)

1. tail-anchored --> C-terminale dentro ER --> sintetizzo nel citosol --> pre-

targeting complex e Get3 (usa ATP) riconoscono segnale e lo portano all'ER

--> get2 e get1 inseriscono la proteina nell'ER

---> ripiegamento e maturazione delle proteine

• ripiegamento: chaperoni nel lume (co-trad) --> ambiente molto affollato

1. chaperoni : non alterano proteine (es BIP)

2. proteine: modificano covalentemente la proteine

BiP

• è il più abbondante, Grp78 (78 = peso molecolare --> fa parte degli Hsp70:lega

regioni idrofobiche)

• ha 2 domini Atpasici dove attacca la proteina

• aiuta con la traslocazione (spesa ATP per il rilascio)

N-glicosilazione

• molte proteine e enzimi sono glicosilati --> protegge delle proteasi, serve da

controllo di qualità

• segnale N-ammino- sequenza S\T --> si leg