Schemi di Biologia molecolare

La PCR ha rivoluzionato numerosi

ambiti della biologia e della medicina.

Viene utilizzata, ad esempio, per

recuperare DNA da fossili,

consentendo studi di genetica

evolutiva. In medicina forense, è

impiegata per identificare individui a

partire da tracce biologiche minime,

come sangue o capelli, prelevate da

una scena del crimine.

Nella PCR vengono utilizzati due tipi di

primer: il forward primer, che si lega al

filamento superiore del DNA stampo, e

il reverse primer, che si lega al

filamento inferiore. Per verificare il

corretto funzionamento della reazione,

si effettuano due controlli:

-Un controllo positivo, in cui vengono

inseriti tutti i componenti necessari, e

ci si aspetta la formazione di un

prodotto amplificato.

-Un controllo negativo, in cui manca

almeno un componente essenziale (ad

esempio il DNA stampo), e in cui non

dovrebbe verificarsi alcuna

amplificazione. Se nel controllo

negativo si osserva comunque un

prodotto, significa che c’è stata una

contaminazione.

Esistono diverse varianti della PCR,

sviluppate per scopi specifici. Tra le

più importanti troviamo:

-PCR quantitativa (qPCR o Real-Time

PCR)

-PCR con retrotrascrizione (RT-PCR)

La PCR quantitativa (qPCR) è una

tecnica che non solo amplifica il DNA,

ma permette anche di quantificarlo in

tempo reale, misurando la quantità di

DNA amplificato in ogni ciclo. Questo

avviene grazie all’uso di molecole

fluorescenti, che emettono luce in

modo proporzionale alla quantità di

DNA presente.

Se il campione iniziale è costituito da

RNA, prima di eseguire la PCR è

necessario convertirlo in cDNA

attraverso un processo chiamato

retrotrascrizione. Questa tecnica è alla

base della RT-PCR (Reverse

Transcription PCR), che consente di

studiare l’espressione genica e

rilevare virus a RNA, come il SARS-

CoV-2.

Nella PCR quantitativa (qPCR),

l’amplificazione del DNA viene

monitorata in tempo reale grazie

all’utilizzo di molecole fluorescenti.

Queste molecole permettono di

misurare la quantità di DNA prodotto in

ciascun ciclo, fornendo informazioni

preziose sulla quantità di DNA

presente inizialmente nel campione.

Esistono due principali metodi di

rilevazione della fluorescenza nella

qPCR:

1. Uso di coloranti intercalanti,

come il SYBR Green

2. Uso di sonde specifiche, come le

sonde TaqMan

Il SYBR Green è un colorante

fluorescente che si può legare al DNA

a doppio filamento. Quando il DNA

viene amplificato durante la fase di

estensione della PC