Schemi Biologia molecolare

Le sonde TaqMan invece sono brevi

sequenze di DNA progettate per

legarsi in modo specifico alla regione

bersaglio del DNA. Ogni sonda è

composta da:

-Un fluoroforo, una molecola che

emette fluorescenza.

-Un quencher, una molecola che

spegne la fluorescenza del fluoroforo

quando è vicina ad esso.

Durante la fase di estensione della

PCR, la DNA polimerasi degrada la

sonda TaqMan, separando il fluoroforo

dal quencher. Quando ciò avviene, il

fluoroforo può finalmente emettere

fluorescenza, che viene rilevata dalla

macchina di PCR in tempo reale.

I vantaggi delle sonde TaqMan sono

che hanno un’altissima specificità,

poiché la sonda si lega solo alla

sequenza target, e una maggiore

precisione, poiché non vengono

rilevati prodotti indesiderati.

Lo svantaggio delle sonde TaqMan è il

costo più elevato, poiché ogni sonda

deve essere progettata per una

specifica sequenza di DNA.

Alla fine di una qPCR, il software

analizza l’aumento della fluorescenza

e genera un grafico di amplificazione,

che mostra l’accumulo di fluorescenza

in funzione del numero di cicli.

Uno dei parametri più importanti di

questa analisi è il Ciclo Soglia (Ct),

ovvero il ciclo in cui la fluorescenza

supera una soglia predeterminata.

Questo valore è inversamente

proporzionale alla quantità iniziale di

DNA nel campione:

-Se il Ct è basso, significa che nel

campione iniziale c’era una quantità

elevata di DNA, poiché

l’amplificazione è avvenuta

rapidamente.

-Se il Ct è alto, significa che la

quantità iniziale di DNA era bassa,

poiché sono stati necessari più cicli

per raggiungere il livello di

fluorescenza rilevabile.

Quindi alla fine di una qPCR, l’analisi

dei dati si basa sul grafico di

amplificazione, che mostra l’aumento

della fluorescenza nel tempo, in

funzione del numero di cicli. Il

parametro chiave per l’interpretazione

dei dati è il ciclo soglia (Ct).

Il Ct rappresenta il numero di cicli

necessario affinché la fluorescenza

superi una soglia prestabilita. Questo

valore è inversamente proporzionale

alla quantità iniziale di DNA nel

campione:

Ct basso → il DNA era abbondante

all’inizio, quindi l’amplificazione ha

raggiunto rapidamente il livello di

fluorescenza rilevabile.

Ct alto → il DNA iniziale era scarso e

sono stati necessari più cicli per

ottenere una quantità sufficiente di

prodotto amplificato.

Grazi