Schemi Biologia molecolare

Per eseguire la PCR, è necessario un

termociclatore, uno strumento che

permette rapide variazioni di

temperatura, essenziali per i vari step

della reazione.

La PCR si divide in tre fasi principali:

1. Denaturazione

La temperatura viene aumentata fino a

92-94°C per separare i due filamenti di

DNA stampo, rompendo i legami

idrogeno tra le basi complementari.

2. Annealing (Appaiamento dei

primer)

La temperatura viene abbassata a 50-

65°C (a seconda delle caratteristiche

dei primer) per permettere ai primer di

legarsi alle sequenze complementari

del DNA stampo.

3. Estensione (Sintesi del nuovo

filamento)

La temperatura viene portata a 72°C,

ottimale per l’attività della Taq

polimerasi, che inizia la sintesi del

nuovo filamento di DNA a partire dai

primer. La sintesi avviene nella

direzione 5’ → 3’.

Un aspetto importante della Taq

polimerasi è che non possiede attività

esonucleasica di proofreading

(correzione di errori), quindi non è in

grado di correggere eventuali errori

durante la sintesi del DNA.

Questi tre passaggi vengono ripetuti

per 30-40 cicli, con un’amplificazione

esponenziale del frammento di

interesse.

La Polymerase Chain Reaction (PCR)

è una tecnica fondamentale in biologia

molecolare, utilizzata per amplificare

specifiche regioni di DNA attraverso

una serie di cicli di amplificazione.

L’intero processo si basa su tre fasi

principali: denaturazione, annealing e

sintesi del nuovo filamento di DNA.

Durante la denaturazione, il DNA a

doppio filamento viene esposto a

temperature elevate, generalmente tra

92 e 94°C, affinché i due filamenti si

separino. Successivamente, nella fase

di annealing, la temperatura viene

abbassata a un valore compreso tra

50 e 65°C, permettendo ai primer di

appaiarsi alle sequenze

complementari del DNA stampo.

Infine, nella fase di estensione, la

temperatura viene portata a 72°C,

condizione ottimale per l’attività della

Taq polimerasi, l’enzima che sintetizza

il nuovo filamento di DNA a partire dai

primer.

Questa sequenza di tre fasi costituisce

un ciclo di PCR. Tuttavia, la PCR non

si basa su un singolo ciclo, bensì su

numerosi cicli ripetuti

consecutivamente. Nel primo ciclo, la

sequenza target viene raddoppiata,

nel secondo ciclo quadruplicata, nel

terzo ciclo viene amplificata otto volte,

e così via. Questo porta a una crescita

esponenziale del DNA amplificato, che

segue un andamento prevedibile:

inizialmente, il prodotto cresce in

modo rapido e