Prelievi venosi in laboratorio

Esempi

Bilirubina:

L'attività pseudo-perossidasica dell’emoglobina può interferire inibendo la

formazione di colore del diazonio

Il picco di assorbimento della bilirubina è a 454 nm come la ossiHb:

interferenza

può essere ridotta sottraendo l’assorbanza del campione a 540 nm dove Hb ha

un altro picco di assorbimento.

Bilirubinometri Bilirubinometriper ittero neonatale: letture a 454 e 540 nm.

Metodo fotometrico non valido negli adulti in cui altri pigmenti interferiscono a

454 nm

Bilirubina diretta: non èdeterminabile in campione emolizzato;

la lettura a 530 nm si sovrappone all’assorbanza dell’Hb

Ferro: non saràsolo quello plasmatico!

• Fosfatasi alcalina: emolisi marcata interferisce (lettura a 405 nm)

• CK: L’adenilatochinasi contenuta nel GR può interferire sull’attivitàCK

totale sierica e sulla separazione isoenzimatica; mentre il dosaggio

immunochimico dell’isoenzima CK-MB (massa) non ne risente.

• Colesterolo, NEFA

• Acidi biliari

• Erronea conta cellulare nell’emocromo

• Le proteasi liberate dalle cellule possono ridurre l'attivitàdei fattori di

coagulazione

UN CAMPIONE EMOLIZZATO NON SI ANALIZZA, se è leggermente Emolizzato e

ciò non influisce quantitativamente sul marcatore si può fare.

Test da non seguire nemmeno per emolisi lievi:

NSE (Neuron Specific Enolase) (monit. terapia e progress. small cell lung

cancer)

Calcitonina

Insulina

Bilirubina

Acidi biliari

Ferro

isoenzimi LDH

Potassio, LDH, GOT

GESTIONE DEI CAMPIONI EMOLIZZATI (Sibioc- Plebani, Padova)

In presenza di un campione emolizzato per il quale sono richieste analisi di

chimica

clinica (generale), vengono definite le seguenti linee guida per la refertazione:

•Emolisi inferiore a 0.5 g/Ldi emoglobina: nessuna segnalazione, tutti gli esami

vanno refertati.

•Emolisi tra 0.5 e 2.0 g/L: vanno refertati sia i risultati del Potassio che degli

enzimi, accompagnati dal commento

•Emolisi superiore a 2.0 g/L: vanno soppressi solo i risultati di AST e LDH,

accompagnati dal commento

•Campione laccato: èopportuno non refertare.

Il grado di emolisi viene valutato visivamente per confronto con la scala

allegata.

Per evitare emolisi durante prelievo:

- AGO: misura idonea

- Non togliere provetta dal vuoto prima di riempirla

- NO SIRINGA

- NO travasi del campione

Altre cause di campione non analizzabile:

Contaminazione da liquidi di infusione parenterale: ad esempio, un paziente

che riceve liquidi per via endovenosa, il prelievo di sangue dello stesso braccio

che riceve i liquidi può essere causa stessa di contaminazione; se flebo al

sinistro, prelievo al destro, altrimenti si sospende per qualche minuto la cura, si

aspetta qualche minuto, si effettua il prelievo e si inietta nuovamente la cura,

si preleva anche qualche provetta di sangue di scarto per evitare di considerare

nell’analisi i residui della terapia.

Contaminazione ed anticoagulanti

Anticoagulante più comune: eparina

Si differenziano le provette in base al loro contenuto e si distribuiscono in base

al colore del tappo.

Provette per sangue intero: no additivo, tappo bianco (si ha rivestimento nero

all’interno del tappo)

Provette siero: no additivi, se ci sono induttore di coagulazione (per

velocizzarla, gn. Sali di silicio); nella coagulazione, fibrinogeno diventa fibrina

- Rosso

- Giallo, contengono gel separatore di parte corpuscolata da siero

(differenziazione glico fisica)

Provette del plasma: contengono anticoagulanti (no coagulazione), gn.

Fibrinogeno

PLASMA: sangue privato degli elementi corpuscolati

Si ottiene da sangue prelevato con anticoagulante separandolo dagli elementi

corpuscolati con centrifugazione a 2000 rpm per 10 min.

SIERO: plasma privato del fibrinogeno

Si ottiene dal sangue intero senza aggiunta di anticoagulanti

Ø coagulazione (30 – 60 min a t° ambiente)

Ø retrazione del coagulo

Ø separazione per centrifugazione (4000 rpm per 10-15 min.)

I campioni devono essere refrigerati quelli di plasma possono essere manipolati

poco dopo il prelievo, soffrono però della presenza di una sostanza

anticoagulante chimico che fa da interferente (esempio: EDTA).

I campioni di siero gn stabili e la coagulazione che porta la fibrina, se i suoi

filamenti non vengono correttamente separati possono interferire col siero e

creare problemi nell’analisi.

ANTICOAGULANTI PRINCIPALI:

• Eparina

EPARINA (1%) tappo viola

· anticoagulante naturale estratto dal fegato animale

· altera la morfologia dei leucociti

· provoca aggregazione delle piastrine

· è l’anticoagulante che interferisce di meno con le determinazioni enzimatiche

Conc ottimale: 0,1-0,2 mg/1 mL di sangue

-L’eparina chela il calcio, ma se nel campione devo analizzare calcio endogeno

inserisc già calcio-eparina;

-Mai dosare litio eparina perché è un antipsicotico

-Reagisce con troppi acidi biliari

-Ammonio, dosaggio per analisi d’urgenza, se concentrazioni elevate il paziente

sta per morire (modifica del pH sanguigno); ammoniaca si misura in campione

eparinato refrigerato (sennò è gassoso ed evapora) se si fuma e si lavora senza

DPI può essere contaminato, perché le sigarette vengono trattate con vapori di

ammoniaca.

L’eparina si lega all’antitrombina 3a per bloccare la trombina, che ha il compito

di facilitare la tarsforazione da fibrinogeno e fibrina (quindi eparina fa da

anticoagulante)

• EDTA (acido etilendiaminotetracetico) tappo viola

sale bisodico o bipotassico (più solubile)

Fa da anticoagulante perché sottrae il calcio dal sangue; però se dovessi dosare

il sangue non posso utilizzarlo e in generale lega tutti i cationi divalenti; per

usarlo si usa il sale corrispondente.

• Citrato tappo azzurro e nero

-azzurro: meno conc. (Test coagulazione)

-nero: più conc. (Per misurare la VES, velocità di eritrosedimentazione)

PROVETTE DEVONO ESSERE PIENE, se sono a metà devono essere respinte,

altrimenti la concentrazione di anticoagulante non sarebbe quella attesa.

• Sodio fluoruro/ ossalato di potassio (tappo grigio)

Serve per misurare glucosio e acido lattico (è un antiglicolitico, misura il

glucosio nel sangue perché blocca la glicolisi che lo consumerebbe); è la prima

provetta a analizzare perché sennò Emolizza, perché HF è un acido forte e

modifica pH del sangue e provoca emolisi chimica).

NB: si preleva prima il siero poi il sangue, perché altrimenti c’è rischio di

contaminazione di anticoagulante tramite l’AGO in silicone che è dentro la

provetta.

• Attivatore coagulo, siero tappo rosso

• Gel separatore siero

Contaminazione da anticoagulanti

MAI UNIRE PROVETTE, MAI TRAVASI E MANTENERE SEMPRE L’ORDINE DELLE

PROVETTE.

Contaminazione da farmaci

Numerosi farmaci possono interferire con i reattivi sovrastimando o

sottostimando il risultato di un test

• Meccanismi di ossidazione (acido ascorbico, penicillina..) e legami chimici con

analita o reattivi

• Metodiche immunochimiche

• Metodiche enzimatiche

Bilirubina, creatinina, amilasi,fosfatasi acida, acido urico, fattore reumatoide,

complemento.

Se si ha un campione e si nota la contaminazione da farmaci, o si rimanda

indietro il campione o si dichiara che è presente un farmaco interferente.

Il prelievo e la successiva analisi puntano ad analizzare lo stato base di un

paziente, non quello corretto dalla terapia.

prelievo con siringa: microcoaguli possono formarsi prima che il sangue sia

trasferito nelle provette con anticoagulante

miscelare bene le provette subito dopo prelievo!

→ anticoagulante per essere efficace deve essere disperso in modo omogeneo

in tutto il campione (per inversione 8-10 volte)

→ anche provette per siero con additivi(per inversione

4-5 volte)

coagulazione richiederebbe più tempo rischio di coaguli durante il dosaggio.

Si deve essere a digiuno prima del prelievo: se si ingerisce qualcosa, i

trigliceridi aumentano immediatamente (LIPEMIA, eccesso di lipidi nel sangue).

Il siero lipemico appare torbido o lattescente (chilomicroni dopo pasto grasso)

Come interferisce? Per torbidità del campione ed interferenza nei dosaggi

basati sull’assorbimento della luce.

Matrice lipidica può bloccare legami anticorpali nei dosaggi immunochimici

-Interferenze nell'analisi spettrofotometrica

Lipemia interferisce sull’assorbimento della luce in quasi tutte

le misure fotometriche

Il risultato apparente può essere aumentato o ridotto

-Effetto volume

Le lipoproteine possono far diminuire la concentrazione di

analiti riducendo l'acqua disponibile nel campione, poichéil volume occupato

dalle lipoproteine in plasma o siero èincluso

nel calcolo della concentrazione dell’analita.

Es. piùbasso potassio e sodio in sieri lipemici

-Interferenza da meccanismi fisico-chimici (matrice)

-Metodiche enzimatiche

-Metodi immunochimici in cui lipidi possono interferire nei legami con anticorpi

-Metodi elettroforetici e cromatografici

Nei campioni di sangue è visibile soltanto per concentrazioni di trigliceridi >

1000 mg/dL (11.3 mmol/L)

• nel plasma o siero visibile già a concentrazioni > 300

mg/dL (> 3.4 mmol/L)

Esami ematologici sono influenzati dalla lipemia.

Il laboratorio deve conoscere per ogni metodo il limite al di sopra del quale

l’ittero crea interferenza analitica (limite di applicazione): è marrone per

eccesso di bilirubina (proteina prodotto di degradazione dell’Hb) —>

interferenze chimiche o analitiche

Altra causa di rifiuto del campione: Insufficiente

Provette e anticoagulante

• E’ necessario che il rapporto tra sangue ed anticoagulante sia sempre

costante e corretto (raccomandazioni NCCLS)

• è necessario utilizzare provette sottovuoto (sistema chiuso di prelievo,

raccomandabile anche per motivi di sicurezza).

Esempio: se una provetta di plasma eparina da 5 mL viene riempita solo con 3

mL di sangue, l’eparina in eccesso potrebbe interferire con alcuni analiti.

Ogni analisi ha un volume ottimale.

La quantità di campione necessaria per eseguire un test dipende da:

• volume campione previsto per singolo dosaggio

• Il volume spazio-morto dell’analizzatore

• La quantità di campione richiesta per N tests ed eventuali ripetizioni

• Il volume di plasma è in relazione al rispettivo ematocrito!

Se ho metà campione, moltiplico il risultato p