Antibiotici e chemioterapici

Meccanismi di Resistenza cromosomica:

Ridotta affinità per il bersaglio: se l'antibiotico ha un suo bersaglio

 specifico la mutazione potrebbe interessare il gene che produce quel

bersaglio, andandolo a modificare l'antibiotico non lo potrà più riconoscere

e quindi il ceppo diventerà resistente.

Iperproduzione del bersaglio: l'antibiotico si legherà al bersaglio ma

 siccome viene prodotto in grossi quantitativi la funzione di quel bersaglio

non verrà inficiata.

Meccanismi di resistenza extracromosomica:

Inattivazione intracellulare dell'antibiotico: provocata dalla produzione di

 enzimi che inattivano l'antibiotico come la β-lattamasi.

Diminuita penetrazione dell'antibiotico nella cellula batterica: dovuta

 alla produzione di trasportatori di membrana che eliminano

l'antibiotico dalla cellula.

Sostituzione del bersaglio: il bersaglio di un antibiotico viene sostituito da

 un'altra molecola che svolge la stessa funzione.

Un'altra ragione per cui c'è un eccesso di ceppi resistenti è quella che quando

un medico prescrive un antibiotico lo fa a largo spettro perché non fa delle

indagini preliminari per trovare un antibiotico che sia effettivamente specifico

per quel responsabile di quella determinata infezione. Questo è un male

perché contribuisce alla farmaco-resistenza di molti ceppi.

Vediamo la tecnica della determinazione della concentrazione minima

inibente che è la concentrazione che stabilisce il dosaggio minimo inibente

cioè ci dice qual è il limite tra la concentrazione efficace e la concentrazione

non efficace. Una volta stabilita la concentrazione minima inibente che sarà

verificata anche per vedere se questa concentrazione minima inibente è

statica o cida. Da queste provette in cui si va a stabilire qual è la

concentrazione e si fanno delle diluizioni al dimezzamento per stabilire qual è il

range efficace, quindi la concentrazione dell'antibiotico viene dimezzata, la

concentrazione della sospensione rimane costante in tutte le provette,

mettiamo ad incubare ed avremo delle risposte differenti nelle varie provette.

In alcune provette si ha la torbidità perché la concentrazione è troppo bassa

per impedire la crescita del microrganismo, mentre altre sono limpide perché

le concentrazioni sono efficaci che non hanno permesso la crescita di nessun

microrganismo. La concentrazione minima inibente è la più bassa

concentrazione dell'antibiotico cha ha impedito la crescita microbica per cui è

20 mg/L. La domanda successiva è se questa concentrazione è veramente

efficace e ha determinato la morte delle cellule o sono in uno stato statico per

cui riprenderanno nel momento in cui si allontana l'antibiotico? A questo punto

prenderemo un'ansata da questa provetta e la metteremo su piastra

con terreno specifico, se crescono vuol dire che l'azione è batteriostatica

mentre se non crescono è battericida. Questo è un macrometodo perché si

utilizzano le provette.

Invece spesso si usa il micrometodo cioè si utilizzano delle piastre a pozzetti in

cui possiamo fare la stessa prova con quantitativi molto più ridotti della

sospensione dell'antibiotico. Si fanno molti controlli negativi perché la lettura

sarà fatta con una serie di pozzetti in cui non ci sarà crescita perché non

metteremo nè l'antibiotico nè il microrganismo, controlli positivi con pozzetti in

cui avremo il massimo della crescita perché abbiamo messo il microrganismo.

Sono diverse concentrazioni di varie molecole che stiamo saggiando e

mettiamo in evidenza la torbidità per cui usiamo uno spettrofotometro per le

piastre e vedremo la torbidità di queste piastre comparate con il controllo

negativo che sarà lo zero e con il controllo positivo che sarà il massimo

possibile da quella sospensione. Poi si colorano per poterle vedere bene anche

nel tempo. Inoltre è difficile trovare delle molecole antibiotiche che agiscano

bene nei confronti gram negativi perché sono molto più resistenti.

La tecnica dell'antibiogramma o di kirby bauer ci permette di saggiare più

antibiotici contemporaneamente ed è un metodo altamente standardizzato

nella composizione del terreno perché i componenti del terreno non devono

interferire sull'attività dell'antibiotico e la piastra deve essere preparata con un

quantitativo di terreno costante. Ad esempio se andiamo dal dottore perché

abbiamo mal di gola, il medico ci dirà di fare un tampone faringeo che verrà

fatto in laboratorio e il tampone verrà seminato direttamente nella piastra

contenente un terreno specifico per la presunzione di microrganismo che

vogliamo isolare. Una volta isolato l'organismo lo si deve cimentare con

l'antibiotico e passano alcuni giorni. Quindi la tecnica dell'antibiogramma

prevede di allestire una sospensione e di metterla in una fase

metabolicamente attiva (perché l'antibiotico funziona soltanto quando le

cellule non sono in quiescenza) per due ore in modo che raggiunga la fase

esponenziale, prendiamo il tamponcino e lo imbeviamo nella sospensione che

avrà una certa torbidità e la seminiamo sulla superficie del terreno agarizzato.

Una volta seminato con questo tamponcino in maniera omogenea perché si

deve ottenere una patina, mettiamo i dischetti nell'antibiotico. La dose che

stiamo saggiando è quella che abbiamo determinato con la concentrazione

minima inibente. Dopo 24-48 ore avremo tutta una serie di risposte che ci

permetteranno di dire se è efficace o no.

ESPERIMENTO

Abbiamo vari esempi di piastre già pronte in cui si vede l'antibiotico e una

patina funginea quindi sono delle candide che sono cresciute ad eccezione

nelle zone in cui la concentrazione dell'antibiotico è stata efficace, infatti ci

sono antibiotici antimicotici poco efficaci o nullo efficaci mentre altri

determinano un'inibizione chiamata alone di inibizione che andremo a

misurare in millimetri. Quando siamo in laboratorio dobbiamo essere in grado di

capire quale è più efficace tra quelli presenti e ci sono delle tabelle di

riferimento che ci dicono perché ogni antibiotico può avere una propria

solubilità nel terreno per cui alcuni che danno un alone di inibizione più piccoli

perché sono poco solubili quindi hanno costruito dei range di riferimento per

dire quando considerare sensibile o resistente un determinato antibiotico.

Quindi misuriamo i diametri e vediamo in una piastra un effetto in cui gli

organismi sono sensibili ad entrambi gli antibiotici e c'è un effetto

congiunto per cui l'alone di inibizione sarà molto più grande. In un’altra piastra

vediamo un caso strano perché il dischetto contiene la dose che abbiamo

messo dell'antibiotico e abbiamo un effetto diffusione che si esplica sia in

orizzontale che in verticale e per questo dobbiamo considerare il terreno

sempre costante in modo da considerare soltanto la diffusione orizzontale

perché sennò avremo dei comportamenti anomali; in questo caso intorno al

dischetto abbiamo la massima concentrazione e via via si avrà la diffusione

cioè la diminuzione della concentrazione dell'antibiotico, quindi in questa

piastra abbiamo un effetto anomalo perché vediamo che alla concentrazione

maggiore abbiamo la presenza di un certo numero di colonie funginee di

candida e poi abbiamo un alone grande di inibizione. Questo avviene perché in

questo caso abbiamo messo in evidenza quei ceppi che sono parte della

popolazione che è resistente e quindi questa popolazione non è più così

omogenea come pensavamo ma ha delle colonie resistenti, cellule che erano

già resistenti a monte e che mettiamo in evidenza con l'antibiotico. Non

possiamo consigliare questo antibiotico al paziente perché siccome sono i suoi

batteri faremmo più danno che altro perché selezioneremmo la popolazione

resistente e la faringite del paziente peggiorerà sempre di più

ANTIBIOGRAMMA

Se sappiamo che il batterio studiato è sensibile a particolari antibiotici

sappiamo già quali usare. Ma soprattutto oggi esistono molti batteri che hanno

sviluppato resistenza agli antibiotici per via dell’utilizzo spropositato di questi

ultimi da parte dell’uomo. Motivo per cui non sapendo a quale antibiotico il

batterio è sensibile è necessario fare l’antibiogramma testando la sua

antibiotico sensibilità.

MIC= “minima concentrazione inibente”, sono le basse concentrazioni di

antibiotico che riescono ad inibire la crescita del batterio.

I test che facciamo sono test in vitro, che ci dicono se il batterio è sensibile

all’antibiotico o meno. Per fare questi test si può utilizzare un terreno liquido o

un terreno solido e alla fine si vede una risposta se il batterio cresce vuol dire

che è resistente all’antibiotico, se non cresce vuol dire che la sua crescita è

stata inibita dall’antibiotico. Nel terreno liquido la crescita si vede perché il

liquido diventa torbido, nel terreno solido crescono le colonie.

MBC=”minima concentrazione battericida” se inibisce non è detto che il

batterio muore, dunque esiste una concentrazione sempre bassa in cui il

batterio viene ucciso, quantomeno il 99% della popolazione.

La cosa fondamentale di questi test è che tutti i metodi in uso vengano

standardizzati. Esiste la CLSI Clinical Laboratory Standards Institute e la 2006

ne è nata una europea l’EUCAST e sono dei gruppi di ricerca che forniscono a

tutta la comunità europea il modo con cui fare un antibiogramma, una MIC,

ecc…

Dobbiamo partire sempre da una coltura pura e da un’inoculo standard.

Uno dei primi metodi è il macro metodo “metodo della diluizione in brodo”.

Macro metodo perché si fa in brodo in delle provette. Si diluisce non il batterio,

ma l’antibiotico, perché vogliamo trovare la concentrazione attiva

dell’antibiotico. Quindi inizialmente abbiamo in tutte le provette lo stesso

terreno, e poi facciamo delle diluizioni con l’antibiotico con riduzioni scalari a

W/2. Dopo si inocula il batterio 5x10alla quinta CFU/ml. Si semina il batterio e si

incuba per 18 ore a 37°. Dove la concentrazione dell’antibiotico è più bassa

continueranno a crescere i batteri, ma via via si sona che ci sarà una diluizione

in cui l’antibiotico ha fatto effetto e ha inibito la crescita, questa concentrazione

si chiama la minima concentrazione inibente che