Analisi tossicologica

SPME

SPME sta per “Solid Phase Micro Extraction” ma anche per “Solventless Phase Micro

Extraction”. Con l’SPME non usiamo solventi, è una microestrazione che non usa solventi

organici.

Questa estrazione avviene in una siringa con all’interno una fibra di silice fusa a cui viene

aggiunto il materiale attivo nella parte finale.

Visto che parliamo di uno strato molto sottile, sono molto delicate queste fibre, di conseguenza

quando andate a utilizzarle, voi usate dei vial che sono i classici per head space (lo spazio di

testa). Perciò mettete il vostro campione in questi vial con setto poroso in matrice, andate a

chiuderlo e poi inserite all’interno questa siringa, dovete forare il setto. Questa fibra è molto

delicata, di conseguenza, se voi provate con la fibra esposta a forare il setto, si frantuma in

mille pezzi, si sbriciola. Quindi per tutta la durata delle operazioni, la fibra rimane sempre

all’interno di questo ago molto robusto che viene usato per forare il setto dell’headspace.

Questa non è una tecnica esaustiva che permette di recuperare tutto il materiale, è una tecnica

di equilibrio, bisogna lavorare in condizioni standardizzate.

Si sfruttano due processi:

la ripartizione

 lo spazio di testa, gli analiti passano dal campione allo spazio di testa e dallo spazio di

 testa alla fibra.

SPME DELLO SPAZIO DI TEST

Se siete in questa condizione, quindi avete il vostro analita che si ripartisce tra tre fasi: la

matrice acquosa, lo spazio di testa e la fibra. Quindi la concentrazione totale del vostro analita,

che indichiamo con C , che si trova nel vostro volume di campione V , sarà dato dalla somma

0 s

della concentrazione del vostro analita distribuito sulle tre fasi. Quindi concentrazione della

fibra moltiplicata per il volume della fibra che abbiamo, quindi la fase adsorbente.

Potrebbe essere nello spazio di testa, quindi abbiamo una certa concentrazione del vostro

analita che si disperde nel volume che avete nello spazio di testa, oppure una parte può

rimanere nel campione e quindi è moltiplicata per il volume complessivo del campione.

Normalmente la quantità più grande rimane nel campione e il resto invece si va a ripartire sulle

due fasi. 37

Entrano in gioco i fattori di distribuzione del nostro campione tra le tre fasi. Questi sono i tre

coefficienti di distribuzione che vi rendono conto di quanto si ripartisce nelle tre parti e che

vanno aggiunte nella vostra espressione.

Se consideriamo lo spazio di testa, avremo che la quantità di campione che determiniamo,

indicata con un generico n, sarà data dalla concentrazione che abbiamo nella fibra moltiplicato

per il suo volume. È una porzione piccola rispetto al totale, quindi considerate che parliamo di

una frazione molto bassa. Questa frazione che si va a ripartire sulla fibra sarà funzione di tutti

gli equilibri che abbiamo appena visto.

Arrivate quindi all’espressione generale che vi dice come si ripartisce il campione nello spazio

di testa.

Per usare questa tecnica l’analita deve essere volatile, per aiutare questo processo scaldiamo,

agitiamo e aggiungiamo i Sali; questo aiuta la ripartizione di un liquido in un gas. Gli analiti

devono essere neutri. Quindi dovete controllare il pH e aggiustarli in modo che siano neutri. Se

no, potete scaldare fin che volete ma vi rimangono in soluzione acquosa.

Se gli analiti non sono volatili possiamo derivatizzarli.

Se lavoriamo con lo spazio di testa siamo sicuramente nelle condizioni dove non abbiamo

interferenze con la matrice; quindi tutte le volte che si può è preferibile utilizzare questa

modalità. Se avete un campione molto sporco, avendo una quantità di fibra molto limitata,

rischiate che, lavorando per immersione, tutti i siti superficiali vengono occupati da qualcosa

che sta interferendo con il nostro analita. Quindi se lavoriamo con lo spazio di testa,

sicuramente voi riuscite a non avere problemi di interferenze, quindi è più adatta come tipo di

analisi. Tutte le volte che è possibile, è meglio lavorare con lo spazio di testa.

SPME DIRETTO

Nell’SPME diretto la fibra viene immersa direttamente nel campione, stiamo lavorando per

catturare delle molecole che non sono volatili, quindi saranno un po’ presenti dentro nel

campione, un po’ si ripartiscono.

Possiamo trascurare il volume della fibra rispetto al volume totale V , quindi otteniamo:

S

Possiamo utilizzare diverse fibre in questa tecnica, rispetto all’SPE giochiamo sia sulla tipologia

sia sullo spessore.

Il tempo di estrazione è un fattore che dobbiamo andare a considerare.

DETRMINAZIONE DELLE SOSTANZE DI ABUSO

Vediamo le sostanze principali che andiamo a determinare.

OPPIACEI E OPPIOIDI

Nel campione biologico andiamo a ricercare la morfina e i suoi derivati principali che sono:

codeina, oripavina, tebaina e papaverina. Queste sono le prime quattro strutture che andiamo

a cercare e in aggiunta a questo, passeremo invece a vedere tutti quelli che sono i derivati

sintetici e semisintetici; sicuramente l’eroina e il suo metabolita principale, la seguono

acetilmorfina ma anche tutta una serie di altri derivati che hanno un potenziale che è

uguale/superiore rispetto a quello della morfina e che quindi ha un certo interesse da

determinare.

Per l’estrazione di queste sostanze utilizziamo la SPE a scambio ionico, con scambiatore

cationico. Dobbiamo caricare il campione a pH acido per avere le molecole in forma protonata e

quindi con una carica positiva. Possiamo avere un pH che sia 3-4 così siamo sicuri che l’amino

38

gruppo sia carico positivamente e che non ci sia il problema di dissociazione degli altri gruppi

che sono essenzialmente con un pKa molto più alte.

Per l’eluizione cambiamo il pH e lavoriamo a pH basico, intorno a 10.

Come tecnica cromatografica scegliamo un’HPLC con un rilevatore a fluorescenza o un classico

UV-vis, se non abbiamo a disposizione un spettrometro di massa.

Stiamo parlando ancora delle sostanze iniziali. Non abbiamo ancora considerato il problema dei

metaboliti. Tutto quello che è stato detto vale sul gruppo di sostanze che abbiamo visto e poi

vedremo se effettivamente possiamo estenderlo anche a tutti i metaboliti. In tutte le analisi che

andrete a fare avrete sempre bisogno di identificare almeno uno dei metaboliti anche perché

molto spesso abbiamo delle cinetiche di scomparsa della sostanza iniziale che sono molto

veloci e quindi per aumentare la finestra diagnostica dobbiamo utilizzare anche dei marcatori

che siano legati al metabolismo della struttura.

MORFINA

I derivati della morfina si formano per coniugazione con l’acido glucoronico in posizione 3 o in

posizione 6.

I profili di scomparsa della morfina e dei suoi metaboliti sono sovrapponibili, quindi i due

metaboliti non aumentano la finestra diagnostica.

EROINA

Per l’eroina il picco ematico si raggiunge in tempi molto brevi, pochi minuti. Per verifica

l’assunzione di eroina si cercano i suoi metaboliti, la 6-monoacetilmorfina e la morfina; questi

aumentano la finestra diagnostica. Se consideriamo il caso specifico del plasma con la semplice

eroina riusciamo a vederlo soltanto per pochi minuti; se consideriamo, invece, tutti e tre, sia la

sostanza iniziale che i due metaboliti principali andiamo oltre l’ora. In particolare, se seguiamo

anche la morfina dopo un’ora abbiamo ancora una concentrazione che è molto superiore

rispetto a quella che utilizziamo normalmente come cut-off (10 ng/ml), quindi riusciamo a

vederlo per diverse ore.

Se abbassiamo il cut-off, quindi se riusciamo ad avere una tecnica che è particolarmente

sensibile possiamo ampliare un pochino la finestra diagnostica visto che per questa specifica

determinazione è molto limitata e quindi possiamo passare a qualche ora, in particolare se

seguiamo anche la morfina arriviamo fino a 21 ore. Quindi è ragionevole come finestra se

parliamo di matrici convenzionali. 39

Quando andiamo ad effettuare le analisi su campioni che sono campioni da strada, dobbiamo

tenere conto oltre a quelli che sono i metaboliti principali anche di tutto quello che possiamo

trovare: derivati naturali, sofisticanti e diluenti.

CODEINA

La codeina viene utilizzata anche per scopo farmaceutico, quindi, è molto facile avere

l’assunzione di codeina in modo legale e se andiamo a vedere la conversione la codeina viene

trasformata essenzialmente in morfina e poi nel suo derivato N-demetilato.

Essenzialmente noi seguiamo il rapporto che c'è tra codeina e morfina facendo però attenzione

al fatto che la morfina la monitoriamo anche quando sospettiamo l'assunzione di eroina; quindi,

bisogna assicurarsi che quello che stiamo vedendo derivi effettivamente dalla codeina e non

dall’eroina. Per fare questo oltre a seguire l’evoluzione di queste due specie andiamo a vedere

come varia il rapporto tra le due. Se siamo in presenza di assunzione di codeina, il rapporto tra

codeina e morfina deve essere superiore ad 1. Se diventa inferiore a 1 vuol dire che abbiamo

anche l’assunzione di eroina. Quindi quello che stiamo dosando come morfina deriva non solo

dalla codeina ma anche dall'assunzione di una sostanza d'abuso.

PSICOANALETTICI

COCAINA

Anche nel caso della cocaina andiamo a seguire i suoi metaboliti principali. Le reazioni

principali che subisce sono la demetilazione soprattutto sull’azoto (N-demetilazione) oppure il

distacco dell'anello fenilico. 40

Per distacco del metile legato al gruppo carbossilico troviamo la benzolecgonina; per distacco

della porzione con il gruppo fenilico, troviamo l’ecgonina metil-estere; contemporanea

demetilazione e defenilazione portano all’ecgonina. Questi sono i metaboliti che permettono

di osservare la presenza delle sostanze d'abuso anche su tempi molto lunghi.

Per l’analisi della cocaina e dei suoi metaboliti iniziamo con un SPE a scambio ionico, con

scambiatore cationico e sfruttiamo la protonazione del gruppo amminico.

Dobbiamo tenere conto del fatto che su alcuni metaboliti abbiamo poi la presenza di gruppi

acidi, quindi abbiamo un gruppo carbossilico, abbiamo un OH quindi nella scelta delle

condizioni fare attenzione a quello che si sceglie perché dobbiamo ricordarci anche della

presenza dei gruppi acidi, non soltanto di quelli basici. Per avere i gruppi amminici protonati e i

gruppi carbossilici indissociati lavoriamo a pH intorno a 3-4.

Per l’eluizione variamo drasticamente il pH e andiamo in condizioni basiche. Non abbiamo

criticità, in quel caso se anche dissociamo il resto non importa tanto vogliamo recuperare tutto

quello che c'è sulla colonnina quindi possiamo utilizzare lo stesso metodo che abbiamo

sviluppato per gli oppiacei. Tant'è che normalmente vengono analizzati insieme, usiamo lo

stesso metod