Relazione laboratorio di Microbiologia generale, del secondo giorno

Laboratorio di Microbiologia 2° giorno 17/10/2023

Studentessa: Colaci Evan. matricola: 004291293

Figura 1: diluizione seriale: 1 mL di soluzione madre viene trasferito nella seconda provetta che contiene 9mL di diluente (ad esempio acqua). Poi 1 mL (aliquota) viene prelevato dalla seconda provetta e trasferito nella terza provetta. Il processo di trasferimento dell'aliquota viene ripetuto fino a raggiungere la concentrazione di diluizione desiderata."

Ogni passaggio del nostro lavoro è stato preceduto da comportamenti essenziali al fine di mantenere il nostro campione nelle condizioni più adatte affinché non venga contaminato durante tutta l'esecuzione dell'esperimento, passaggio fondamentale per garantire l'attendibilità dei risultati sperimentali.

Le tecniche di sterilizzazione che abbiamo adottato sono particolarmente importanti quando si lavora con i microrganismi. Una singola spora o un minuscolo batterio possono moltiplicarsi a dismisura.

invadendol'intero terreno e compromettendo l'esperimento.

Procedura applicata:

Le porte del laboratorio si aprono e si chiudono automaticamente al passaggio da un ambiente all'altro, non sono presenti così correnti d'aria che possano agevolare il diffondersi nell'aria di microrganismi presenti sulle superfici.

Tutte Le anse da inoculo e le spatole di vetro sono state sterilizzate prima e dopo il loro utilizzo con un becco Bunsen. Così come le provette i terreni e le attrezzature.

La capacità di quantificare la crescita batterica risulta fondamentale per valutare, di un determinato microrganismo, la resistenza agli antibiotici. Alcuni batteri diventano insensibili a un farmaco specifico o a una classe specifica di farmaci, si è visto che addirittura possono trasferire il gene della resistenza ad altri ceppi della stessa specie, oppure a individui di specie completamente diverse; le strategie attuali si concentrano sulla messa a punto di

nuovi antibiotici con innovative modalità di azione o sullasomministrazione di diversi antibiotici contemporaneamente, presupponendo che un batterio non possa sopravvivere a due o tre antibiotici contemporaneamente. Questa capacità di resistere all'azione degli antibiotici si evolve all'interno di un batterio nel corso di diverse generazioni attraverso, ad esempio, le mutazioni del DNA.

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Figura 1: micrografia a colori di E. coli ottenuta tramite microscopio elettronico a scansione.

E. coli una specie importante negli studi di biotecnologia e microbiologia, dove viene utilizzato come organismo ospite per la maggior parte degli studi sul DNA ricombinante.

Rispondi alle seguenti domande:

1. In base a cosa si possono classificare i terreni di coltura?

I terreni di coltura si classificano in base a tre componenti fondamentali: lo stato fisico del terreno che può essere

sia liquido (brodi) che solido, si può distinguere in base alla sua composizione chimica, terreno minimo, terreno sintetico, dove le sostanze nutritive sono conosciute e quantificate o complesso, dove le sostanze sono molteplici e ricche ma non necessariamente quantificate a priori, ed infine in base alla loro funzione vengono definiti i terreni di arricchimento, terreni selettivi o terreni fermentanti differenziali come l'esempio riportato in figura Escherichia coli () e Salmonella (non fermentante) ad esempio MacConkey Agar oppure Salmonella-Shigella Agar (SS Agar), questi terreni bloccano la crescita di alcuni microrganismi agevolando la crescita invece di altri. Composizione del terreno MacConkey agar: - Peptone di gelatina 17 g/L - Peptoni (carne e caseina) 3 g/L - Lattosio monoidrato 10 g/L (ci permette di separare i fermentanti il lattosio e i non fermentanti) - Sali biliari 1.5 g/L (inibisce la crescita di Gram +) - NaCl 5 g/L - Rosso Neutro 0.030 g/L - Cristalvioletto 0.001 g/L (inibisce)

crescita Gram +)Agar 13.5 g/L• pH finale 7.1±0.2 a 25°C

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Salmonella-Shigella Agar (SS Agar): L' agar Salmonella-Shigella (SS) è un terreno di coltura altamente selettivo e differenziale, usato per l'isolamento selettivo di Shigelle e Salmonelle da campioni. È in grado, infatti, d'inibire la crescita della maggior parte dei batteri coliformi nonché di molti altri batteri Gram positivi e Gram negativi a causa dell'elevata concentrazione di sali biliari e di citrato di sodio

2. Quali metodi conosci per la conservazione a lungo termine dei ceppi batterici?

Essenzialmente conosco due metodi per la conservazione a lungo termine dei ceppi batterici,

- la Crioconservazione è una procedura nella quale la coltura batterica viene mescolata con glicerolo al 20% oppure DMSO all'8% ( si preferisce usare il glicerolo al 20 % per il congelamento

di batteri e il DMSO all'8% per il congelamento di cellule) entrambi crioprotettori e poi posta a -80 °C con un rapido congelamento in modo che l'acqua formi piccoli cristalli per non danneggiare la cellula. Per scongelare passiamo gradualmente da -80°C a -20°C, poi 0°C +4°C ed infine a temperatura ambiente,

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una volta che abbiamo scongelato, si mescola e poi si può proseguire con l'utilizzo che ne dobbiamo fare-

Un altro metodo è quello nel quale le colture all'inizio vengono congelate in modo molto rapido affinché si arresti la loro attività metabolica e poi vengono liofilizzate attraverso la sublimazione inghiaccio (rimuovendo l'acqua).

3. Come si riproducono i microrganismi?

I microrganismi si riproducono attraverso la scissione binaria all'inizio il DNA viene replicato poi si ha un allungamento della cellula

con una formazione di un setto di divisione cellulare completato da una successiva divisione cellulare e la separazione delle due cellule figlie che saranno cloni della madre a livello genetico. Per le muffe il discorso cambia poiché esse, avendo una struttura particolare, la struttura del micelio, in particolare delle ife aeree, esse sono polinucleate e non completamente separate l'una dall'altra, nel momento in cui il micelio si separa per dar vita a nuove cellule, si hanno una serie di divisioni multiple, settate e separate completamente fra di loro, e si ha la formazione di esospore. 4. Quali sono i fattori che influenzano la crescita batterica? I fattori che influenzano la crescita cellulare sono S, cioè il substrato, ossia quella serie di componenti, micro e macroelementi, che devono essere presenti nel terreno di crescita affinché i microrganismi possano crescere; il PH, a seconda del suo valore i microrganismi si classificano in acidofili.neutrofili ed alcalofili, più ci si avvicina al PH ideale, più i microrganismi si riproducono (la velocità di crescita segue la cosiddetta curva gaussiana). Un altro parametro importante è la temperatura, potremo avere microrganismi che crescono bene a temperature fra i 20 °C e i 40°C gli ambientali ad esempio, oltre abbiamo i termofili e gli ipertermofili, che hanno dato origine alla vita. Dall'analisi della curva gaussiana si evince che non c'è ambiente sulla terra che non possa essere colonizzato dai batteri. 5. Quali sono le fasi della curva di crescita? Le fasi della curva di crescita batterica si dividono in fase lag ossia fase di latenza, fase di latenza è una fase di adattamento metabolico con la sintesi di nuovi enzimi e nuove componenti strutturali il numero di cellule resta costante con un leggero aumento volumetrico e ladurata è specie specifica e dipende dal terreno di provenienza e dallo stato metabolico di partenza. La fase log o fase logaritmica è quella in cui le cellule hanno una crescita bilanciata, i costituenti cellulari vengono sintetizzati a una velocità costante, si modificano il numero dei nutrienti e ci sono delle variazioni sul terreno di coltura, si modificano le condizioni ambientali e la crescita non è più bilanciata. In questa fase le cellule sono in fase di riproduzione attiva in una rapida riproduzione e la divisione di ciascuna cellula avviene in modo asincrono. La velocità di crescita è costante nel tempo, il numero delle cellule aumenta e anche la massa cellulare totale con un andamento logaritmico ( Log Nt= log N^0 + n log 2). La fase stazionaria o plateau è quella in cui il numero delle cellule rimane costante, si arresta la riproduzione e si ha un controbilanciamento del tasso di mortalità. Questa fase è la causa delraggiungimento di una densità critica un accumulo di cataboliti tossici è una limitazione dei nutrienti oltre a una limitazione della disponibilità di ossigeno quello che continua in questa fase è il metabolismo energetico e i processi di biosintesi, fase di declino o morte, in questa fase si ha una irreversibile perdita della capacità riproduttiva il numero delle cellule vitali diminuisce. Esponenzialmente se non si va incontro alla lisi batterica, la conta totale delle cellule e la sua densità potrebbero rimanere costanti. 6. Perché la curva di crescita è una rappresentazione grafica di tipo "semilogaritmico" Come esempio utilizziamo la riproduzione di una cellula, la quale si divide ogni 30 minuti in due cellule figlie, con una formula matematica al t(tempo) uguale a 0, avremo 1 cellula (cellula madre), al tempo t=30 minuti avremo 2 cellule figlie, al tempo t=60 minuti avremo 8 cellule figlie quindi l'andamento.che segue la crescita cellulare è un andamento di tipo esponenziale. Tramite il logaritmo possiamo ricavare il numero di divisioni cellulari in base al numero di cellule che abbiamo dopo un certo intervallo di tempo, infatti dopo 5 ore e mezzo avremo un totale di 2048 cellule, da cui si evince la velocità con cui il numero delle cellule aumenta.

• Linearizzazione della curva: la sua pendenza (slope) ci dice quanto velocemente cresce la popolazione cellulare.
• Dal grafico semilogaritmico si può calcolare il tempo di generazione, cioè il tempo necessario a una cellula per duplicarsi. In quale fase misureresti il tempo di generazione?

Il tempo di generazione o il tempo necessario a una cellula per duplicarsi è ottenuto dalla formula matematica del tempo fratto il numero di generazioni a quello stesso tempo quindi Tg è uguale al t / n, il tempo.di sviluppo e maturazione delle cellule. Durante questa fase, le cellule subiscono una serie di cambiamenti morfologici e funzionali che le portano a diventare cellule mature e specializzate. La degenerazione può essere causata da diversi fattori, come l'invecchiamento, l'esposizione a agenti tossici o dannosi, l'accumulo di sostanze nocive all'interno delle cellule, o problemi genetici. Questi fattori possono compromettere la normale funzione delle cellule e portare a un deterioramento delle loro capacità. La degenerazione cellulare può manifestarsi in diversi modi, a seconda del tipo di cellula coinvolta e dei fattori che ne causano la degenerazione. Ad esempio, nel caso delle cellule nervose, la degenerazione può portare a malattie neurodegenerative come l'Alzheimer o il Parkinson. In generale, la degenerazione cellulare è un processo naturale che fa parte dell'invecchiamento e dell'usura del corpo, ma può essere accelerata da fattori esterni. Per prevenire o rallentare la degenerazione cellulare, è importante adottare uno stile di vita sano, evitare l'esposizione a sostanze nocive, seguire una dieta equilibrata e praticare regolarmente attività fisica.