Relazione di Biochimica

Relazione di laboratorio di biochimica - Utilizzo della tecnica di Western Blotting all'interno di una pubblicazione scientifica

Descrizione della tecnica:

La tecnica western blotting è una tecnica biochimica che ha lo scopo di separare le proteine contenute in un campione in base al loro peso molecolare ed esaminare la presenza di specifiche proteine e la loro espressione tramite l'utilizzo di anticorpi specifici. Inizialmente si devono ottenere le proteine separate in base al loro peso molecolare su di un gel di poliacrilamide tramite SDS-PAGE; a questo punto di devono trasferire le proteine su di un foglio di nitrocellulosa (blotting proteico) assemblando un "sandwich" formato da un supporto in plastica, un tessuto spugnoso, un foglio di carta da filtro, il gel della SDS-PAGE con le proteine separate in base al loro peso molecolare, il foglio di nitrocellulosa, un altro foglio di carta da filtro, un altro strato di tessuto spugnoso ed un ultimo supporto di plastica.

A questo punto si trasferiscono le proteine dal gel al foglio di nitrocellulosa mediante elettroforesi; dato che le proteine nel gel sono cariche negativamente la parte del gel va rivolta verso l'anodo mentre quella del foglio di nitrocellulosa verso il catodo. Eseguito il blotting proteico, le proteine presenti nel foglio vengono incubate con un anticorpo specifico e successivamente con un anticorpo secondario che andandosi a legare a quello specifico fungerà da amplificatore di segnale oltre che da tracciante; infine analizzando il segnale proveniente dall'anticorpo secondario si può risalire alla presenza e ai livelli di espressione della proteina di interesse. Analisi dell'articolo scientifico La pubblicazione scientifica dalla quale ho scelto di riportare e commentare la tecnica di western blotting ha titolo "ROS-indipendent Nrf2 activation in prostate cancer". L'articolo tratta dell'attivazione di Nrf2 (fattore 2 relativo a NF-E2) acausa di stress ossidativo che innesca un meccanismo di sopravvivenza adattativo e di ripristino dell'omeostasi nelle cellule del cancro alla prostata; viene dimostrata una correlazione tra l'attivazione di Nrf2 e l'espressione della proteina GRP78/BiP sulla superficie cellulare, causata da un induttore di stress del reticolo endoplasmatico (tunicamicina TM), che va a migliorare la resistenza all'apoptosi. Viene quindi identificato un possibile metodo immunoterapeutico contro il cancro alla prostata utilizzando anticorpi anti-GRP78/BiP in quanto il blocco di GRP78/BiP bloccherebbe anche l'attivazione di Nrf2 che andrebbe a sua volta a bloccare alcuni dei numerosi meccanismi di protezione molecolare sfruttati dalle cellule tumorali aggressive. Nella pubblicazione, la tecnica di western blotting viene utilizzata varie volte per scopi differenti, il primo impiego di tale tecnica è dimostrare che la tunicamicina (TM) porta all'attivazione di Nrf2. A talescopo viene prima eseguita una SDS-PAGE per 6 campioni di estratti proteici di cellule tumorali PC3 che differiscono per il tempo di incubazione con TC e successivamente viene trasferito il risultato su di un foglio di nitrocellulosa per elettroforesi a 100V per un'ora. La proteina istonica H3 viene utilizzata come controllo, e per rilevarle H3 e Nrf2 la membrana di nitrocellulosa viene trattata con anticorpi anti-H3 e anticorpi anti-Nrf2 che vengono poi accoppiati ad anticorpi HRP per poter essere rilevati attraverso chemiluminescenza.

Le analisi densitometriche rivelano un progressivo aumento di Nrf2 all'aumentare del tempo di incubazione con TC dimostrando gli effetti della tunicamicina sui livelli di Nrf2 delle cellule PC3. All'interno di questa pubblicazione scientifica la tecnica di western blotting viene utilizzata altre volte e per altri scopi: per analizzare l'intero meccanismo biologico che scatena il

trattamento con tunicamicina (andando anche ad analizzare l'attivazione di certe proteine interessandosi alla loro forma fosforilata) fino a dimostrare che la TC induce alla traslocazione di GRP78/BiP sulla superficie delle cellule PC3;

Figura 2. Analisi del meccanismo biologico scatenato da TC.

per dimostrare che il trattamento delle cellule PC3 con anticorpi del dominio C-terminale anti-GRP78/BiP attenua l'attivazione di Nrf2;