Relazione di laboratorio di Microbiologia

LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA

3. Differenze fra preparato a fresco e preparato colorato

Nel preparato a fresco il campione non subisce alcuna modifica, il

campione viene posto direttamente sul vetrino dove è stata

precedentemente posta una goccia di acqua, questa metodica permette

di osservare le cellule nella loro dimensione e forma originale; nel

preparato colorato, invece, attraverso le varie fasi di colorazione, si riesce

a mettere maggiormente in evidenza le diverse cellule, aumentando il

contrasto tra esse e l’ambiente in cui sono immerse.

4. Cos’è e a cosa serve il “vetrino a goccia pendente”?

È un particolare vetrino cavo al centro, utilizzato nei preparati a fresco a

goccia pendente in alternativa al metodo per schiacciamento.

5. Quale test può essere usato in alternativa della colorazione di gram?

Il test dell’ossidasi (per verificare la presenza del citocromo-c ossidasi,

enzima presente in molti batteri), e il test della catalasi (per verificare la

presenza dell'enzima catalasi, presente in gran parte dei batteri aerobici).

“Quantificazione dei batteri tramite coltura”

In questa simulazione si osservano le tecniche per la ricerca di nuovi

composti germicidi per combattere ceppi di batteri resistenti agli

antibiotici, e le successive tecniche per contare il numero di batteri

viventi in una soluzione. La prima fase prevede l’utilizzo del campione

estratto da un fungo che viene fatto agire su cellule di E. coli. Dopo una

notte di incubazione si è osservato come la provetta di controllo si

presenta offuscata per la proliferazione del batterio, mentre la provetta

col composto fungino ha rallentato tale proliferazione. Per stabilire

l’efficacia del composto fungino è stato necessario quantificare il numero

di cellule batteriche viventi. Per far ciò, si preparano due piastre, una di

controllo e una sperimentale. Dopo l’incubazione ogni cellula batterica

sulla piastra di agar si moltiplica in milioni di cellule, creando delle colonie

visibili ad occhio nudo. Dal numero di colonie è possibile dedurre quanti

batteri ci sono in tutto il campione attraverso la formula (num. di colonie /

volume utilizzato per spalmare = ….cfu/mL) dove CFU è unità formanti

colonie, da cui è possibile dedurre le cellule batteriche vitali presenti

inizialmente nella provetta. A questo punto si procede con la conta delle

cellule batteriche nel campione di controllo. In questo caso è stato

necessario effettuare una serie di diluizioni per diminuire la

concentrazione finché non è stato possibile contare le colonie su una delle

LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA

piastre di agar. Dai conteggi è emerso che il fungo rallenta la crescita

batterica. Per verificare l’efficacia germicida del composto è stato

necessario creare ulteriori campioni con diluizione seriale ogni 24 ore.

Dall’osservazione dei risultati ogni 24, 48, 72 e 96 ore di incubazione, si è

dedotto che il fungo compie sui batteri un’azione batteriostatica, cioè ne

rallenta la crescita ma non li uccide.

“Controllo della crescita microbica: esplora la decontaminazione e la

tossicità selettiva”

La simulazione in esame descrive le tecniche di decontaminazione

disponibili in un laboratorio e il test di suscettibilità ai farmaci

antimicrobici attraverso un test di diffusione su disco.

Partendo dalla richiesta della dentista Giulia, che, a seguito della cura di

uno dei suoi pazienti da una brutta infezione dentale, chiede l’intervento

del laboratorio per comprendere le cause della recidiva dell’infezione. Il

paziente, infatti, era stato curato nel 2019 da un forte ascesso con la

Penicillina,

prescrizione di che sembrava far effetto fino al ripresentarsi

dell’infezione. La richiesta della dentista riguarda sia la decontaminazione

della sonda e della bacinella utilizzata per il paziente infetto, oltre ad

indagare sulle cause di tale infezione.

La prima fase della simulazione riguarda le tecniche di decontaminazione.

classificazione di Spaulding,

Grazie alla che suddivide gli strumenti in tre

categorie in base al rischio di infezione che il loro utilizzo comporta, nello

critici

specifico in (per es. forcipi bisturi, strumenti introdotti in tessuti

normalmente sterili o nel sistema vascolare che necessitano di essere

semicritici

sterilizzati usando il vapore o altro metodo alternativo), (per

es. endoscopi e speculum, specchietti dentali, strumenti che vanno a

contatto con pelle o mucose integre, devono essere sottoposti a

sterilizzazione con vapore o come minimo a disinfezione ad alto livello)

non critici (per es. stetoscopio, padella e stampelle, strumenti che

entrano a contatto con la sola cute integra e non con le mucose,

richiedono una disinfezione di basso livello), è stato possibile classificare

la sonda e la bacinella come oggetti semicritici.

Partendo dalla rimozione dello sporco e dei detriti attraverso un lavaggio

con detergente, si passa all’inserimento degli strumenti nell’autoclave,

all’interno di un sacchetto di sterilizzazione con indicatore. Tale macchina

utilizza le alte temperature, il vapore e la pressione, creando un ambiente

dove microrganismi, spore e proteine prioniche vengono distrutti.

LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA

A questo punto della simulazione, si è passato ad indagare sul campione

estratto dal paziente infetto.

La prima fase riguarda i risultati dei test del 2019 (ABG e E-test). Dal test

ABG si deduce che i batteri erano sensibili a tre diversi agenti, ciò è

evidente dalla presenza delle “aree di inibizione” uno spazio intorno a un

disco impregnato di antibiotico dove i batteri sensibili non possono

crescere. Maggiore è l’area, più efficace è l’azione antimicrobica. Dal test

dell’epsilometria, invece, è stato possibile definire a che concentrazione

un farmaco diventa efficace (MIC concentrazione minima inibitoria).

L’interpretazione dei dati ha confermato la scelta dell’utilizzo della

penicillina nel caso in esame.

A questo si è passati ad analizzare il nuovo campione, utilizzando la

tecnica di antibiogramma chiamata metodo di diffusione in agar. Si usano

dei dischi filtranti impregnati di agenti chimici per indagare quanto i

batteri siano sensibili alla penicillina.

Dopo aver aggiunto la coltura alla piastra di agar sangue (piastra

contenente sangue di pecora) utilizzando un’ansa da inoculo per

distribuire uniformemente la coltura sulla piastra, abbiamo preparato un

disco di controllo negativo, un disco di controllo positivo con l’ipoclorito e

un disco con la penicillina. In contemporanea sono stati preparati altri

dischi con la coltura batterica del 2019, cosi da verificare gli effetti tra le

due colture.

Dall’analisi dei risultati, che mostra come la penicillina non abbia

dimostrato efficacia nell’ultimo campione del paziente, e quindi i batteri

sono in grado di esprimere un enzima in grado di inattivare la penicillina

prima che essa possa legarsi alla transpeptidasi della parete cellulare,

diversamente da quanto emerso sul campione del 2019, ciò ha portato a

dedurre che alcune cellule della vecchia infezione hanno sviluppato

resistenza alla penicillina e non sono state eliminate dalla cura

precedente, causando la nuova infezione.

A questo punto si è scelto di utilizzare altri due agenti, strutturalmente

diversi dalla penicillina e che esercitano la loro azione con mezzi

differenti. Metronidazolo,

Il primo agente è il che attacca il DNA delle cellule

Clindamicina

microbiche, mentre il secondo agente è la che colpisce il

ribosoma.

Infine, dopo aver restituito gli strumenti decontaminati, si è discusso con

la dentista Giulia dei risultati dei test, proponendo per la paziente, inoltre,

l’utilizzo della clorexidina, un antisettico efficace come collutorio al 0,2 %.