Relazione di Laboratorio di Biologia molecolare

Procedura per l'estrazione del DNA

K durante la lisi cellulare avvenuta precedentemente, riducendo nuovamente le tempistiche. Figura 9. Prelievo di 25ml filtrato. Figura 10. Aggiunta di 5ml di succo di ananas.

6. In una provetta aggiungere in egual volume (4ml) la soluzione contenente il DNA ed etanolo puro freddo. Il DNA è insolubile negli alcoli per cui l'aggiunta di un alcol freddo ne provoca la rapida aggregazione sotto forma di sospensione solida rimuovendo anche i sali legati al DNA. In laboratorio si può utilizzare qualsiasi alcol freddo anche a catena maggiore, in quanto la solubilità del DNA diminuisce all'aumentare dello scheletro carbonioso ed al diminuire della temperatura. Figura 11. Aggiunta di 4ml di soluzione di DNA. Figura 12. Aggiunta di 4ml di etanolo freddo.

7. Il DNA è stato ora estratto ed isolato ed è visibile come sospensione gelatinosa e filamentosa all'interno della provetta. Se fossimo in laboratorio potremmo centrifugare la soluzione, ottenendo il DNA come...

Pellet ed eliminando l'etanolo con la micropipetta ed essiccando il pellet. Successivamente si potrebbe poi risospendere in specifici buffer o acqua sterile per analizzarlo ulteriormente, per esempio attraverso spettrofotometria potremo avere informazioni qualitative o quantitative del DNA appena estratto.

Figura 13. Inizio della precipitazione. Figura 14. DNA precipitato in sospensione.

Conclusione: L'estrazione del DNA dalla banana è andata a buon fine in quanto il DNA è visibile come sospensione all'interno della provetta. Per valutarne la purezza e la quantità, al fine di avere dati sulla resa dell'estrazione, sarebbero necessarie altre analisi, effettuabili solamente in laboratorio servendosi di strumenti specifici, come uno spettrofotometro. Potendo eseguire tale analisi, se il DNA estratto fosse relativamente puro, bisognerebbe aspettarsi una curva spettrofotometrica avente un picco di assorbanza a 260nm, lunghezza d'onda alla quale le basi.

Le basi azotate del DNA sono in grado di assorbire la radiazione elettromagnetica. Ed analizzando più in dettaglio tale picco si può poi risalire alla concentrazione di DNA presente nell'estratto, tenendo conto che per ogni u.a. (unità di assorbimento) a 260nm corrisponde ad una concentrazione di DNA nella soluzione inserita nella cuvetta di 50μg/ml. Descrizione della tecnica di PCR. La tecnica di PCR (Polymerase Chain Reaction; reazione a catena della DNA polimerasi) è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare in modo esponenziale e selettivo un target di DNA di interesse. La tecnica si serve di un processo automatizzato e veloce che consiste nel ripetersi varie volte di un ciclo di riscaldamento e raffreddamento svolto per mezzo di un termociclatore. Per poter effettuare una PCR è necessario estrarre il DNA contenente anche il target di interesse in modo che sia solubilizzato in un buffer che ne mantenga un valore di pH ottimale per la

reazione. Sarà poi necessario avere nell'apposita provetta per PCR:

• DNA contenente il target di interesse
• Buffer stabilizzatore di pH
• +2 Ioni Mg (MgCl₂)
• Due primers selettivi
• I 4 deossinucleotidi trifosfato (dNTPs)
• DNA polimerasi resistente alle alte temperature (Taq polimerasi)

Gli ioni Mg sono in grado di influenzare l'appaiamento dei primer allo stampo e quindi l'efficienza della Taq polimerasi; essendo la loro concentrazione inversamente proporzionale alla specificità di appaiamento sono quindi uno strumento di controllo, se per esempio in seguito alla reazione di PCR non ho ottenuto l'amplificazione programmata, significa che la specificità dei primer è troppo alta e posso quindi ripetere la reazione aumentando la concentrazione di ioni Mg⁺².

I due primer selettivi sono piccoli frammenti di DNA (circa 20 nucleotidi) a singola elica, nelle due rispettive direzioni, progettati in modo da appaiarsi selettivamente.

(quindi essendo antiparalleli) agli estremi alla porzione di DNA target che abbiamo intenzione di amplificare. I 4 dNTPs sono il materiale di cui saranno formati i nuovi filamenti di DNA amplificati e a loro volta usati come stampo. La Taq polimerasi è una DNA polimerasi batterica, ricavata da batteri che vivono in fonti termali in condizioni di elevate temperature, che hanno quindi la peculiarità di resistere e compiere il loro ruolo di sintesi del DNA anche a temperature elevate. Una volta preparata la provetta per PCR contenente tutto quello precedentemente descritto si procede inserendola nel termociclatore nel quale avverrà il ciclo di reazioni di amplificazione. Il ciclo è composto da 3 fasi:

1. "denaturation", consiste nella denaturazione del DNA ovvero la separazione di esso nelle due singole eliche complementari (avviene a 95°C).
2. "annealing", consiste nell'appaiamento dei primers alle sequenze complementari sul DNA, può

avvenire a temperature diverse, solitamente a 58°C, ma può essere regolata in base ai risultati fungendo anch'essa da regolatore di selettività come la concentrazione di ioni Mg; ma, a differenza di quest'ultima, la temperatura di annealing è direttamente proporzionale alla specificità di appaiamento per cui al fine di avere una minore specificità sarà necessario diminuire la temperatura di annealing. 3. "elongation", consiste nell'allungamento, e quindi nella sintesi, ad opera della Taq polimerasi, del filamento di DNA iniziato dai primers ottenendo così, per ogni ciclo, un quantitativo di target a doppia elica doppio, formato da un filamento stampo "vecchio" ed uno "nuovo" appena sintetizzato (il tutto è in grado di avvenire a 72°C date le peculiarità della Taq polimerasi). Così facendo, per ogni ciclo, si otterrà il doppio della quantità di target.rispetto al ciclo precedente, osservando così un aumento esponenziale. Tale aumento esponenziale è osservabile entro un certo range di cicli che solitamente non supera mai i 40-45, dopo i quali la curva di prodotto amplificato si trova in una fase stazionaria "effetto plateau" dove l'amplificazione è nulla o quasi. Il raggiungimento del plateau è provocato da vari fattori, tra cui l'inibizione da accumulo di prodotto da parte del pirofosfato e l'esaurimento di reagenti come la Taq polimerasi che a causa degli stress termici perde il suo ruolo ed efficienza enzimatica. Concludendo, la PCR è quindi una reazione esponenziale che permette di ottenere enormi quantità di porzioni di DNA target partendo anche da piccole quantità di campione. Le applicazioni e i rispettivi campi di applicazione sono numerosissimi; generalmente la si esegue per qualsiasi analisi si voglia effettuare sul DNA, che sia un sequenziamento, una qualsiasi

1. analisi di confronto del DNA su campioni diversi per controllare la presenza o meno di geni uguali
2. determinazioni di paternità
3. analisi tassonomiche ed evoluzionistiche

Per qualsiasi di queste analisi è necessario effettuare una PCR per selezionare e replicare la o le porzioni di DNA di interesse. Da tenere presente è anche la possibilità di ottenere risultati soddisfacenti anche da "tracce" di DNA, essendo, per cui, anche una metodica di analisi forense utilizzata per risolvere crimini, confrontando tracce di DNA raccolte sulla scena del crimine con campioni di DNA dei sospettati.

Blast (Basic Local Allignment Search Tool) è un metodo utilizzato per confrontare sequenze nucleotidiche o proteiche basato sul confronto, attraverso uno specifico algoritmo, della sequenza che si vuole esaminare con un vastissimo database. Esistono vari database, confrontabili sui rispettivi siti internet.

Blast e commento di sequenze nucleotidiche assegnate.

Introduzione

su cui è possibile eseguire un Blast; il principale è l'NCBI, contenente il maggior numero di informazioni confrontabili, soprattutto per quel che riguarda la specie Homo sapiens.

Attraverso il Blast di una Query (sequenza da esaminare) di DNA si possono ricavare informazioni come: un allineamento visivo tra la Query e le sequenze in database, il punteggio di tale allineamento (che ne indica la similarità), un valore dei possibili allineamenti casuali, il numero di basi identiche tra le sequenze confrontate, il numero di gap (lacune nella sequenza). In base a questi dati si può poi risalire alla sequenza in data base che più rispecchia la Query, ricevendo varie informazioni sul gene, su ciò che codifica, sulle possibili mutazioni e relative conseguenze patologiche, ecc.

Sequenze assegnate:

1. La prima Query (2170bp) corrisponde alla parte di 2170bp che si trova in posizione 50-2219bp del genoma completo del virus SARS CoV2 isolato Wuhan-Hu-1. Altre due...

1. La prima Query (1876bp) corrisponde alla parte di 1876 bp che si trova in posizione 47-1922bp del genoma completo del virus SARS CoV2 isolato Wuhan-Hu-1. Corrispondenze, meno complete e con lacune al loro interno sono state riscontrate all'interno del genoma completo di altri due virus: SARS CoV2 isolato Tor2 (porzione di 1876bp in posizione 47-1922bp con 38 gap); e Pipistrello coronavirus BM48-31/BGR/2008 (porzione di 1847bp in posizione 1-1847bp con 44 gap).

2. La seconda Query (3640bp) corrisponde alla parte di 3640 bp che si trova in posizione 2220-5859bp del genoma completo del virus SARS CoV2 isolato Wuhan-Hu-1. Una corrispondenza, seppur incompleta e con alcune lacune è stata riscontrata anche nel genoma completo del virus Pipistrello coronavirus BM48-31/BGR/2008 per una porzione di 1571bp in posizione 4053-5623bp con 51 gap.

3. La terza Query (5040bp) corrisponde alla parte di 5038bp che si trova in posizione 5860-10899 del genoma completo del virus SARS CoV2 isolato Wuhan-Hu-1. Altre due corrispondenze, meno complete e con lacune al loro interno sono state riscontrare all'interno del genoma completo di altri due virus: SARS CoV2 isolato Tor2 (porzione di 5038bp in posizione 5860-10899 con 38 gap); e Pipistrello coronavirus BM48-31/BGR/2008 (porzione di 5038bp in posizione 5860-10899 con 44 gap).

CoV2 isolato Tor2 (porzione di 3934bp in posizione 5790-10823bp con 82 gap); e Pipistrello coronavirus BM48-31/BGR/2008 (porzione di 3861bp in posizione 5783-10726bp con 81 gap).

La quarta Query (7560bp) corrisponde alla parte di 7554bp con 9 gap che si trova in posizione 10900-18468 del genoma completo del virus SARS CoV2 isolato Wuhan-Hu-1. Altre corrispondenze sono state riscontrate con numerosi altri coronavirus, alcuni che colpiscono gli umani, altri altre specie tra le più corrispondenti i pipistrelli. Tuttavia, le due corrispondenze migliori, come per le altre Query, sono state con il genoma completo di: SARS CoV2 isolato Tor2 (porzione di 6565bp in posizione 10831-18388bp con 39 gap); e Pipistrello c