Relazione di Laboratorio di Biologia Molecolare

Analisi della sequenza mutata

Nella sequenza mutata ho una Guanina che ha sostituito la Citosina: GCATCCCGCTGGACAGCGCTTACGATCCAGACTGAGGAAGCTTTG. Per cui la sequenza nucleotidica tradotta su DNA Translate tool con questa sequenza mutata mi dà questa sequenza amminoacidica modificata: I P L D S A Y D P D - G S F.

L'amminoacido nella posizione 159 non c'è più. Con questa mutazione, il nucleotide per Serina quindi l'espressione della proteina termina (da TCA a TGA), nella posizione del nucleotide p.Ser159ter.159 con questo risultato.

Ho effettuato un'ulteriore ricerca su OMIM, relativamente al gene in esame, al fine di individuare le sue caratteristiche ed eventuali disordini metabolici che una sua mutazione può indurre. Di seguito sono elencate alcune patogenesi connesse a mutazioni del gene PCDH19:

Le protocoladerine formano una sottofamiglia di molecole di adesione cellula-cellula calcio-dipendenti nella

superfamiglia caderina. Protocadherin-19 appartiene a una sottoclasse diprotocaderine che condividono un motivo citoplasmatico di 17-aminoacidi altamente conservato. PCDH19 appartiene alla sottoclasse delta-2 protocaderine della superfamiglia. Clonazione ed espressione Sequenziando i cloni ottenuti da una libreria di cDNA del cervello fetale, Nagase et al. (2000) clonarono il PCDH19, che chiamarono KIAA1313. Con la RT-PCR ELISA hanno rilevato un'espressione moderata in tutte le regioni del cervello esaminate, con livelli più bassi rilevati nel cervelletto. Espressione moderata è stata trovata anche nell'ovaio e bassa espressione in tutti gli altri tessuti testati. Tramite la ricerca nel database sono state identificate 3 nuove protocaderine, PCDH19, PCDH10 (608286) e PCDH18 (608287), che condividono un motivo citoplasmatico di 17-aminoacidi altamente conservato (CM2) con PCDH8 (603580). La proteina per il PCDH19 tradotta da 1.149 aminoacidi ha una massa molecolare.

teorica di 126 kD. Tutti e 4 questi protocolli contengono 6 domini di ripetizione extracellulare (EC) simili allacaderina. Contrariamente all'espressione specifica del PCDH8, RT-PCR ha dimostrato l'espressione di PCDH19, PCDH10 e PCDH18 non solo nel cervello ma anche nel cuore, nei reni, nei polmoni e nella trachea. Anche il PCDH18 è stato espresso nel fegato e il PCDH10 ha mostrato una riduzione dell'espressione tracheale rispetto a PCDH19 E PCDH18. Dibbens et al. (2008) hanno scoperto che il gene PCDH19 mostra uno splicing alternativo dell'esone 2. L'analisi Northern blot ha rilevato una trascrizione dell'mRNA di 9,8 kb in varie aree del cervello adulto maschile e femminile.

Mappatura: Dall'analisi ibrida delle radiazioni, Nagase et al. (2000) hanno mappato il gene PCDH19 sul cromosoma X. Il gene PCDH19 è mappato su Xq22 (di cui alla precedente illustrazione).

Funzione genica: Dibbens et al. (2008) hanno trovato espressione del gene PCDH19

Nello sviluppo del sistema nervoso centrale umano e del topo, compresi l'ippocampo e la corteccia, suggerendo un ruolo nella funzione cognitiva. L'espressione non è stata rilevata nei tratti della sostanza bianca.

Genetica molecolare

In pazienti di sesso femminile con sindrome di epilessia limitata a donne e ritardo mentale (EFMR), nota anche come encefalopatia epilettica infantile precoce-9 (EIEE9; 300088), Dibbens et al. (2008) hanno identificato 6 diverse mutazioni nel gene PCDH19 (ad es. 300460.0001 - 300460.0005). La maggior parte delle varianti ha comportato l'interruzione delle proteine e il decadimento missenso. È stato previsto che due mutazioni missenso (ad es. V441E, 300460.0002) influenzano l'adesività del PCDH19 attraverso un legame con il calcio compromesso.

Patogenesi

Dibbens et al. (2008) hanno proposto un'ipotesi per spiegare lo stato clinicamente inalterato dei portatori maschi con mutazioni ematiche di PCDH19.

Poiché il gene PCDH19 è soggetto a inattivazione X, i maschi emittenti che trasmettono probabilmente hanno una popolazione omogenea di cellule PCDH19 negative, mentre le femmine colpite sono probabilmente mosaici comprendenti cellule PCDH19 negative e PCDH19-wildtype. Questo mosaicismo tessutale nelle femmine può confondere la comunicazione cellula-cellula, che si manifesta clinicamente come encefalopatia epilettica infantile precoce. Nei maschi, gli autori hanno postulato il salvataggio funzionale da un gene correlato ma non paralogo del cromosoma Y, PCDH11Y (400022), che è espresso nel cervello umano. PCDH11Y ha un paralogo del cromosoma X, PCDH11X (300246), che mostra una forte somiglianza nella sequenza. Tuttavia, le differenze nei modelli di espressione cerebrale tra questi 2 geni possono spiegare la capacità differenziale di compensare l'assenza di PCDH19. Infine, per analizzare nello specifico cosa la mia mutazione può causare avendo

Una terminazione dell'espressione amminoacidica per la Serina con relativo stop della proteina, interrogo nuovamente Ensembl GRCh37 per capire se questa terminazione in questa particolare sequenza provochi o meno una patologia nota. Investigando il database ho riscontrato questo risultato: "Una variante di sequenza su questa base (G al posto di C) porta alla modifica del relativo codone (nr. 158), causando un codone di stop prematuro, e quindi a una trascrizione abbreviata" (vedasi figura seguente). Posso quindi concludere che una mutazione della sequenza in questa specifica regione del gene PCDH19 porta ad una trascrizione abbreviata, come sopra descritto, ma non patogenesi o disordini metabolici noti.

D S N.G.S. ESCRIZIONE DEI METODI DI SEQUENZIAMENTO ANGER E E LORO, .APPLICAZIONI SIMILITUDINI E DIFFERENZE

COS'È IL SEQUENZIAMENTO

Sequenziare significa determinare l'ordine esatto dei monomeri che formano una biomolecola. Nel caso del DNA, il

Il sequenziamento permette di ricostruire l'ordine dei nucleotidi (A, C, G e T) che formano la molecola. Il sequenziamento del DNA rappresenta il primo passo per comprendere la funzione di un gene e aiuta a identificare le regioni regolatrici da quelle codificanti. L'analisi della sequenza è utile anche per individuare mutazioni o per stabilire correlazioni filogenetiche tra specie diverse.

METODO DI PRIMA GENERAZIONE SANGER: Frederick Sanger mise a punto un metodo che ha permesso di sequenziare frammenti di DNA o interi genomi. Immaginiamo di dover sequenziare solo una porzione di DNA. Prima è necessario amplificarlo, cioè averne molte copie, e per farlo si ricorre alla PCR. A questo punto, le copie amplificate devono essere denaturate, i due filamenti vengono separati grazie ad un aumento della temperatura. Si aggiungono poi altri ingredienti: uno è la DNA polimerasi che sintetizza un nuovo filamento di DNA a partire dal filamento stampo per avviare la sintesi.

è necessario anche un primer prodotto ad hoc per legarsi al DNA da sequenziare. Il servono le unità che compongono il DNA, cioè i desossiribonucleotidi che trasportano le quattro basi azotate. Si aggiunge infine una data quantità di nucleotidi modificati, la modifica riguarda lo zucchero che compone il nucleotide: infatti rispetto ai desossiribonucleotidi manca il gruppo ossidrile in posizione 3'. La chiave di questo metodo di sequenziamento è proprio in questa piccola differenza: il nucleotide modificato è legato ad un marcatore fluorescente indispensabile per poter vedere il risultato. Si usano marcatori fluorescenti di quattro colori diversi, uno per ciascun tipo di base azotata. Completata la miscela si avvia la sintesi di un nuovo filamento di DNA. La DNA polimerasi si lega al primer, e aggiunge un nucleotide alla volta (ovviamente complementare alle basi). Il nuovo filamento si allunga finché sono aggiunti i nucleotidi normali, ma quando

se ne inserisce uno modificato, la sintesi si ferma. (la mancanza del gruppo ossidrile impedisce infatti la formazione di un legame con il nucleotide successivo e provoca il distacco della DNA polimerasi). il risultato di questa fase è la formazione di un frammento di DNA a doppio filamento che ha l'ultimo nucleotide marcato. l'interruzione della sintesi è l'evento cruciale del metodo di Sanger e perciò è chiamato il metodo di terminazione di catena. l'inserimento di un nucleotide modificato è dovuto al caso per cui anche la lunghezza del filamento sintetizzato risulta casuale, ma se la sintesi avviene tante volte grazie alle copie prodotte con la PCR, avremo filamenti di tutte le lunghezze possibili di poche basi o lunghi quanto l'intera porzione di DNA da sequenziare. Nella fase successiva si denatura nuovamente il DNA, i singoli filamenti vengono quindi sottoposti ad elettroforesi capillare, i frammenti di DNA, grazie alle loro

cariche negative dei gruppi fosfato, cominciano a migrare verso il polo positivo, i più corti migrano più velocemente quindi possiamo confrontare la lunghezza dei frammenti in base alla loro velocità. al termine della corsa elettroforetica, un laser eccita i marcatori fluorescenti legati ai nucleotidi modificati e un sensore registra il tipo di luce emessa. abbiamo così tutti gli elementi per ricostruire la sequenza. siccome a ciascuno dei quattro colori corrisponde una diversa base azotata, la sequenza così ottenuta è complementare alla sequenza che si voleva conoscere. lo stesso procedimento può essere usato per ottenere la sequenza di un intero genoma. Per far ciò il genoma viene prima frammentato e il sequenziamento è eseguito sui singoli frammenti. i risultati sono elaborati da un software che trova i punti di sovrapposizione e ricostruisce la sequenza completa. anche in questo caso la sequenza ottenuta è

complementare allasequenza ricercata.Applicazioni:METODO DI SECONDA GENERAZIONE N.G.S.: –le tecniche di nuova generazione (Next Generation Sequencing NGS) sono ormai unostandard della diagnostica genetica molecolare. La NGS è anche chiamata high-throughputsequencing (sequenziamento ad alta resa) perchè, a differenza del sequenziamentotradizionale col metodo Sanger, consente di sequenziare moltissimi frammenti in parallelo.Esistono diversi sistemi NGS, sviluppati da diverse compagnie. Tutti questi sistemi, tuttavia,condividono almeno tre passi fondamentali: la preparazione e immobilizzazione del DNA(cioè la preparazione della cosiddetta libreria), la reazione di amplificazione e la reazione disequenziamento. Riassumendo, la Next Generation Sequencing si caratterizza per:

PREPARAZIONE E IMMOBILIZZAZIONE DEL DNA (OVVERO CREAZIONE DELLALIBRERIA)

Il campione di DNA viene preparato attraverso un processo di frammentazione casuale. Aiframmenti casuali così

ottenuti vengono aggiunte delle sequenze prede