Relazione di Laboratorio di Biologia Molecolare

Relazione laboratorio di biologia molecolare mod. 224-25 luglio 2020

Esercitazione su una sequenza mutata

In questa esercitazione sto analizzando una data sequenza nucleotidica con una specifica mutazione. Per fare ciò dovrò compiere alcuni passaggi che illustrerò di seguito. Devo identificare il gene ed il rispettivo difetto genetico cui questa sequenza appartiene, la sua localizzazione cromosomica, la funzione della proteina codificata ed infine la malattia associata a questo disordine.

Strumenti e metodologie utilizzate

Utilizzo alcuni database per riscontrare la mia sequenza, il primo:

BLAST

BLAST è uno strumento/tool online che mi permette di comparare delle sequenze biologiche specifiche di amminoacidi o nucleotidi (pattern) all’interno del genoma depositato in un database condiviso (nel nostro caso genoma umano). Ovviamente più lunga è la sequenza nucleotidica da comparare, più è specifica la ricerca nel genoma ed avrò minori risultati da analizzare. Al contrario, più è corta, più è probabile che la riscontri in numerosi genomi diversi avendo una specificità minore. Si può inoltre comparare più di una sequenza nucleotidica per volta.

In questo caso specifico sto analizzando nel genoma umano (circa 3 miliardi di sequenze nucleotidiche) una data sequenza con matching del 100%, mi dà come risultato il gene PCDH19 che codifica per la proteina "protocaderina 19", appartenente ad una famiglia di molecole che favoriscono la comunicazione delle cellule del sistema nervoso centrale e che analizzeremo più avanti. La collocazione esatta del gene di mio interesse è posizionato sul cromosoma X: "NM_001105243.2".

Analisi della mutazione

Nella mia stringa di risultato ho potuto riscontrare che i miei 45 nucleotidi si allineano dalla posizione 2116 alla posizione 2160 del mio gene che ne contiene 9615 totali. A questo punto, per analizzare ulteriormente questo gene e sapere che mutazioni note presenta, posso utilizzare un altro database genomico chiamato Ensembl (nello specifico Ensembl GRCh37 che presenta un assembling più affidabile).

Questo database nel menu a sinistra ci mostra numerosi altri tool che possiamo utilizzare per analizzare approfonditamente questo gene come ad esempio le varianti di splicing, confronto tra i trascritti, la struttura secondaria, genomi comparativi, la tabella delle varianti, etc. Io ho scelto di analizzare il trascritto che include 2 varianti: NM e variante ENST00000373034.4 proteica NP.

Ulteriori dati del gene

In questa fase, Ensembl mi dà ulteriori dati come gli esoni presenti, il cDNA, il dominio della proteina, il suo modello 3D, e la localizzazione genomica precisa nel caso di analisi: 3’ – 5’. Chromosome X: 99,546,642-99,665,271 nella direzione reverse strand.

Di seguito il locus della mia mutazione sul cromosoma X braccio lungo posiz. 22.1. A questo punto, selezionando la sequenza nella libreria di cDNA del mio gene, posso comparare la mia sequenza all’interno del trascritto e vedere in che posizione esatta è avvenuta la mutazione (da citosina a guanina nella fattispecie per l’amminoacido Serina).

Sequenza nucleotidica e amminoacidica

Partendo dalla sequenza data: nella figura che segue ho individuato la mia sequenza nucleotidica all’interno del gene e la posizione esatta del nucleotide dove è avvenuta la mutazione:

GCATCCCGCTGGACAGCGCTTACGATCCAGACTCAGGAAGCTTTG

Questa sequenza, in condizioni normali, codifica per gli amminoacidi:

Ile Pro Leu Asp Ser Ala Tyr Asp Pro Asp Ser Gly Ser Phe

Nella sequenza mutata ho una Guanina che ha sostituito la Citosina:

GCATCCCGCTGGACAGCGCTTACGATCCAGACTGAGGAAGCTTTG

Per cui la sequenza nucleotidica tradotta su DNA Translate tool con questa sequenza mutata mi dà questa sequenza amminoacidica modificata: I P L D S A Y D P D - G S F l’amminoacido nella posizione 159 non c’è più.

Effetti della mutazione

Con questa mutazione, il nucleotide per Serina, quindi l’espressione della proteina termina (da TCA a TGA), nella posizione del nucleotide p.Ser159ter.159 con questo risultato:

Ho effettuato un’ulteriore ricerca su OMIM, relativamente al gene in esame, al fine di individuare le sue caratteristiche ed eventuali disordini metabolici che una sua mutazione può indurre. Di seguito sono elencate alcune patogenesi connesse a mutazioni del gene PCDH19:

Patogenesi associata al gene PCDH19

• Le protocoladerine formano una sottofamiglia di molecole di adesione cellula-cellula calcio-dipendenti nella superfamiglia caderina.
• Protocadherin-19 appartiene a una sottoclasse di protocaderine che condividono un motivo citoplasmatico di 17-aminoacidi altamente conservato.
• PCDH19 appartiene alla sottoclasse delta-2 protocaderine della superfamiglia.

Clonazione ed espressione

Sequenziando i cloni ottenuti da una libreria di cDNA del cervello fetale, Nagase et al. (2000) clonarono il PCDH19, che chiamarono KIAA1313. Con la RT-PCR ELISA hanno rilevato un'espressione moderata in tutte le regioni del cervello esaminate, con livelli più bassi rilevati nel cervelletto. Espressione moderata è stata trovata anche nell'ovaio e bassa espressione in tutti gli altri tessuti testati.

Tramite la ricerca nel database sono state identificate 3 nuove protocolliferine, PCDH19, PCDH10 (608286) e PCDH18 (608287), che condividono un motivo citoplasmatico di 17-aminoacidi altamente conservato (CM2) con PCDH8 (603580). La proteina per il PCDH19 tradotta da 1.149 aminoacidi ha una massa molecolare teorica di 1.