Relazione di Biologia molecolare

Procedura dell'esperimento

Durante ogni passaggio dell'esperimento verrà descritta anche la procedura, le sostanze e i materiali che si potrebbero usare qualora ci si trovasse in un laboratorio. Materiali e strumenti

• Campione di frutta (100g di banana).
• Detersivo per piatti.
• Cloruro di sodio (NaCl, sale da cucina).
• Etanolo puro freddo.
• Succo di ananas.
• Acqua.
• Vari contenitori.
• Bilancia da cucina (σ almeno 1g).
• Siringa e pipetta per piccoli volumi.
• Provette da 10ml.
• Imbuto con filtro (carta da filtro o garza).

Procedimento

1. Pesare con la bilancia da cucina 100g di banana e ridurli in poltiglia (per esempio utilizzando una forchetta).

Questa prima operazione ha il compito di liberare il più possibile le cellule dalla struttura aggregata della polpa; tale procedimento può essere eseguito anche all'interno di un laboratorio utilizzando mortaio e pestello che aiuterebbero maggiormente anche la fase di lisi cellulare. Figura 1. Pesata di 100g di polpa di banana.come l'utilizzo di detergenti, enzimi o soluzioni chimiche. Nel caso specifico descritto, si utilizza una soluzione litica composta da detersivo per piatti e sale da cucina. Per preparare la soluzione litica, segui i seguenti passaggi: 1. Prendi un contenitore graduato. 2. Aggiungi 10 ml di detersivo per piatti utilizzando una siringa. 3. Pesane 3 grammi di sale da cucina (NaCl) utilizzando una bilancia. 4. Aggiungi il sale da cucina al contenitore graduato. 5. Aggiungi acqua al contenitore graduato fino a raggiungere un volume totale di 100 ml. La soluzione litica ha due funzioni principali: lisare le cellule e districare la fibra cromatinica. Il detersivo per piatti svolge la funzione di lisare le cellule, sciogliendo la membrana lipidica cellulare e liberando il contenuto della cellula, tra cui il DNA. Il sale da cucina, invece, ha il compito di districare la fibra cromatinica e neutralizzare le cariche negative del DNA, permettendo alle varie molecole di aggregarsi. È importante sottolineare che esistono diversi metodi di lisi cellulare e soluzioni litiche utilizzabili in laboratorio, come metodi meccanici (ad esempio l'utilizzo di mortaio e pestello, omogeneizzazione o estrusione) o metodi non meccanici (come l'utilizzo di detergenti, enzimi o soluzioni chimiche).ad esempio, utilizzando enzimi litici, shock termici oosmotici o soluzioni con detergenti come l'SDS + proteinasi K. Quest'ultima metodica, la lisi mediante SDS e proteinasi K, è la metodica che più rispecchia quella utilizzata durante l'esperimento domestico, in quanto il detergente SDS ha il compito di lisare la membrana cellulare, mentre la proteinasi K ha il compito di digerire le proteine cromatiniche, per esempio le proteine istoniche.

3. Aggiungere la soluzione litica alla polpa sminuzzata, mescolare il composto e lasciare agire per 10 minuti. È necessario mescolare e attendere per permettere alla soluzione litica di svolgere il proprio compito il più efficientemente possibile.

4. Filtrare la miscela di banana e soluzione litica utilizzando un imbuto e un filtro che blocchi la fase.

solida.Tale processo è necessario al fine di separare le molecole di DNA rimaste insoluzione da tutti i residui di lisi cellulare non solubili in acqua.In laboratorio, ipotizzando di aver lisato il nostro campione tramite detergenteSDS e proteinasi K, la separazione può essere svolta tramite l'aggiunta di unamiscela di fenolo-cloroformio e successiva centrifugazione. La miscela fenolo-cloroformio ha il compito di solubilizzare i lipidi e denaturare le proteine, separando efficacemente la fase organica in soluzione fenolica da quellaacquosa (in superficie) contenente il DNA. In laboratorio si potrebbe quindipartire da quantità di campioni molto minori ed ottenendo risultati migliori intermino di purezza e resa. Figura 8. Filtrazione.

5. Prelevare 25ml di filtrato contenente il DNA ed aggiungere 5ml di succo diananas lasciando agire per 5 minuti.Il succo di ananas contiene un enzima, la bromelina, in grado di digerire leproteine istoniche, svolgendo quindi le

molecole di DNA. In laboratorio questo compito verrebbe svolto dalle proteinasi K durante la lisicellulare avvenuta precedentemente, riducendo nuovamente le tempistiche.

Figura 9. Prelievo di 25ml filtrato. Figura 10. Aggiunta di 5ml di succo di ananas.

6. In una provetta aggiungere in egual volume (4ml) la soluzione contenente il DNA ed etanolo puro freddo. Il DNA è insolubile negli alcoli per cui l'aggiunta di un alcol freddo ne provoca la rapida aggregazione sotto forma di sospensione solida rimuovendo anche i sali legati al DNA. In laboratorio si può utilizzare qualsiasi alcol freddo anche a catena maggiore, in quanto la solubilità del DNA diminuisce all'aumentare dello scheletro carbonioso ed al diminuire della temperatura.

Figura 11. Aggiunta di 4ml di soluzione di DNA. Figura 12. Aggiunta di 4ml di etanolo freddo.

7. Il DNA è stato ora estratto ed isolato ed è visibile come sospensione gelatinosa e filamentosa all'interno della

provetta.Se fossimo in laboratorio potremmo centrifugare la soluzione, ottenendo il DNA come pellet ed eliminando l'etanolo con la micropipetta ed essiccando il pellet. Successivamente si potrebbe poi risospendere in specifici buffer o acqua sterile per analizzarlo ulteriormente, per esempio attraverso spettrofotometri potremo avere informazioni qualitative o quantitative del DNA appena estratto.

Conclusione: L'estrazione del DNA dalla banana è andata a buon fine in quanto il DNA è visibile come sospensione all'interno della provetta. Per valutarne la purezza e la quantità, al fine di avere dati sulla resa dell'estrazione, sarebbero necessarie altre analisi, effettuabili solamente in laboratorio servendosi di strumenti specifici, come uno spettrofotometro. Potendo eseguire tale analisi, se il DNA estratto fosse relativamente puro, bisognerebbe aspettarsi una curva.

spettrofotometrica avente un picco di assorbanza a 260nm, lunghezza d'onda alla quale le basi azotate del DNA sono in grado di assorbire la radiazione elettromagnetica. Ed analizzando più in dettaglio tale picco si può poi risalire alla concentrazione di DNA presente nell'estratto, tenendo conto che per ogni u.a. (unità di assorbimento) a 260nm corrisponde ad una concentrazione di DNA nella soluzione inserita nella cuvetta di 50μg/ml.

• Descrizione della tecnica di PCR.

La tecnica di PCR (Polymerase Chain Reaction; reazione a catena della DNA polimerasi) è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare in modo esponenziale e selettivo un target di DNA di interesse. La tecnica si serve di un processo automatizzato e veloce che consiste nel ripetersi varie volte di un ciclo di riscaldamento e raffreddamento svolto per mezzo di un termociclatore. Per poter effettuare una PCR è necessario estrarre il DNA contenente anche il target.

di interesse in modo che sia solubilizzato in un buffer che ne mantenga un valore di pH ottimale per la reazione.

Sarà poi necessario avere nell'apposita provetta per PCR:

• DNA contenente il target di interesse,
• Buffer stabilizzatore di pH,
• +2Ioni Mg (MgCl₂),
• Due primers selettivi,
• I 4 deossinucleotidi trifosfato (dNTPs),
• DNA polimerasi resistente alle alte temperature (Taq polimerasi).

+2Gli ioni Mg sono in grado di influenzare l'appaiamento dei primer allo stampo e quindi l'efficienza della Taq polimerasi; essendo la loro concentrazione inversamente proporzionale alla specificità di appaiamento sono quindi uno strumento di controllo, se per esempio in seguito alla reazione di PCR non ho ottenuto l'amplificazione programmata, significa che la specificità dei primer è troppo alta e posso quindi +2ripetere la reazione aumentando la concentrazione di ioni Mg.

I due primer selettivi sono piccoli frammenti di DNA (circa 20

Il DNA viene amplificato utilizzando la tecnica della PCR (Polymerase Chain Reaction). La PCR è un metodo che permette di ottenere milioni di copie di una specifica sequenza di DNA in modo rapido ed efficiente.

Per effettuare la PCR, è necessario avere una provetta contenente il DNA target che si desidera amplificare, i primers, i deossinucleotidi trifosfati (dNTPs) e la Taq polimerasi.

I primers sono brevi sequenze di DNA, a singola elica, progettati in modo da appaiarsi selettivamente agli estremi della porzione di DNA target che si desidera amplificare. I primers sono antiparalleli e si appaiano alle due eliche complementari del DNA.

I dNTPs sono i mattoncini con cui verranno formati i nuovi filamenti di DNA amplificato. La Taq polimerasi è una DNA polimerasi batterica, isolata da batteri che vivono in fonti termali. Questa polimerasi ha la capacità di resistere e svolgere la sua funzione di sintesi del DNA anche a temperature elevate.

Una volta preparata la provetta per la PCR contenente tutti i componenti descritti, questa viene inserita nel termociclatore. Il termociclatore permette di eseguire il ciclo di amplificazione del DNA.

Il ciclo di amplificazione è composto da tre fasi:

1. Denaturazione: il DNA viene denaturato, ovvero le due eliche complementari vengono separate. Questa fase avviene a una temperatura di 95°C.
2. Annealing: i primers si appaiano alle due eliche complementari del DNA target. Questa fase avviene a una temperatura inferiore a 95°C, specifica per ogni coppia di primers utilizzata.
3. Elongazione: la Taq polimerasi sintetizza i nuovi filamenti di DNA utilizzando i dNTPs come mattoncini. Questa fase avviene a una temperatura di 72°C.

Il ciclo di amplificazione viene ripetuto per un numero definito di volte (solitamente da 25 a 35 cicli) in modo da ottenere un'ampia quantità di copie del DNA target.

consiste nell'appaiamento dei primers alle sequenze complementari sul DNA, può avvenire a temperature diverse, solitamente a 58°C, ma può essere regolata in base ai risultati fungendo anche da regolatore di selettività come la concentrazione di ioni Mg; ma, a differenza di quest'ultima, la temperatura di annealing è direttamente proporzionale alla specificità di appaiamento per cui al fine di avere una minore specificità sarà necessario diminuire la temperatura di annealing. "elongation", consiste nell'allungamento, e quindi nella sintesi, ad opera della Taq polimerasi, del filamento di DNA iniziato dai primers ottenendo così, per ogni ciclo, un quantitativo di target a doppia elica doppio, formato da un filamento stampo "vecchio" ed uno "nuovo" appena sintetizzato (il tutto è in grado di avvenire a 72°C date le peculiarità della Taq.

La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica di amplificazione del DNA che permette di ottenere molte copie di una specifica sequenza di DNA. Questo processo avviene attraverso una serie di cicli termici che coinvolgono la denaturazione del DNA, l'ibridazione degli oligonucleotidi di avvio e allungamento del DNA tramite l'azione di una polimerasi. Così facendo, per ogni ciclo, si otterrà il doppio della quantità di target rispetto al ciclo precedente, osservando così un aumento esponenziale. Tale aumento esponenziale è osservabile entro un certo range di cicli che solitamente non supera mai i 40-45, dopo i quali la curva di prodotto amplificato si trova in una fase stazionaria "effetto plateau" dove l'amplificazione è nulla o quasi. Il raggiungimento del plateau è provocato da vari fattori, tra cui l'inibizione da accumulo di prodotto da parte del pirofosfato e l'esaurimento di reagenti come la Taq polimerasi che a causa degli stress termici perde il suo ruolo ed efficienza enzimatica. Concludendo, la PCR è quindi una reazione esponenziale che permette di ottenere enormi quantità di porzioni di DNA target partendo anche da piccole quantità di campione.