Quaderno di Laboratorio farmacologia sperimentale

ESPERIENZA 1: BINDING ELISA

10 nov 2023

Il saggio immuno assorbente legato a un enzima (ELISA) è una tecnica biomolecolare che si basa su anticorpi specifici per legare l'antigene bersaglio. La specificità dell'interazione antigene-anticorpo è l'elemento cruciale della strategia di rilevamento ELISA.

Per l'esecuzione dell'esperienza le piastre ELISA vengono incubate overnight con il recettore EPH4.2. Questo recettore si lega solo alla plastica della piastra che ha delle caratteristiche di reattività che le permette di legare le proteine in modo aspecifico.

Il passaggio successivo prevede l'aggiunta di efrina A1 biotinilata (ligando fisiologico del recettore EPH4.2) e sarà addizionale biotina che sarà utilizzato per il passaggio successivo.

Si utilizza streptavidina HRP che si lega alla biotina con un legame molto forte, nonostante non sia covalente. HRP è la perossidasi di rafano, la quale è un'enzima che catalizza alcune reazioni tra cui la trasformazione di TMB (tetrametilbenzidina, incolore) in una sostanza colorata di giallo.

Tanto più efrina A1 biotinilata si lega al recettore EPH4.2, tanto più streptavidina HRP si lega a efrina A1 biotinilata, tanto più TMB reagisce e tanto più si osserva il pozzo diventare giallo.

Materiale:

• piastra 96 pozzetti
• pipetta automatica
• spettrofotometro
• EphA2 0,5 μg/mL in PBS
• PBS: 0,1 g/l KCl, 8 g/l NaCl, 0,2 g/l KH₂PO₄, 1,65 g/l Na₂HPO₄, pH 7,4
• washing buffer: PBS + 0,05% tween 20 (0,5 μl/ml), pH 7,5
• blocking buffer: PBS + 0,05% BSA (5 mg/ml)
• autoregolato: 124 μM
• efrina A1 biotinilata 100 ng/ml in PBS
• streptavidina HRP working solution 1:200 in 0.5% BSA (5 mg/ml) pH 4,4
• TMBD in stable peroxide buffer → 0,05M acido citrico (14,3 g/l), 0,05M sodio fosfato (9,4 g/l), pH 5,0
• H₂O₂
• HCl 3N

Procedura:

1. Utilizzare una piastra da 96 pozzetti preparando nel seguente modo:
   • Preparare una soluzione di EPHA2 0,5 μg/ml in PBS
   • Inserire 100 μl/pozzetto di EPHA2 in 16 pozzetti
   • Incubare a 4°C tutta la notte
   • Lavare la piastra 2 volte con 200 μl/pozzetto di washing buffer
   • Bloccare la piastra utilizzando 200 μl/pozzetto di blocking buffer

   Questo passaggio viene fatto perché la plastica della piastra lega le proteine in modo aspecifico, quindi eventuali siti di legame rimasti liberi potrebbero legare il ligando in modo aspecifico, dando colore quando non dovrebbe vederlo.

   • Incubare a 37°C per 30 minuti
2. Rimuovere la blocking solution e lavare la piastra 2 volte con il washing buffer (200 μl/pozzetto)
3. Aggiungere 80 μl di PBS in ogni pozzetto
4. Preparare le diluizioni degli auto-anticorpi partendo da 124 μM:
   • Nel primo pozzetto in alto di una nuova colonna della piastra inserire 50 μl di auto-anticorpi 124 μM e aggiungere 50 μl di PBS, diluendo la soluzione iniziale (1:2) e ottenendo una concentrazione di 62 μM.
   • Prelevare 50 μl dal primo pozzetto e trasferirli nel successivo, operando nuovamente una diluizione (1:2) mediante aggiunta di 50 μl di PBS e ottenendo una concentrazione di 31 μM.
   • Procedere ripetendo il passaggio appena descritto e operando diluizioni successive al fine di ottenere concentrazioni di auto-anticorpi di:
     • 16 μM
     • 8 μM
     • 4 μM
     • 2 μM
5. Prelevare 50 μl di soluzione di auto-anticorpi e riportarli nel pozzetto contenente PBS corrispondente (preparato precedentemente).

   Nel bianco e nel controllo inserire 50 μl di PBS al posto della soluzione di auto-anticorpi.

   Seguire lo schema in pagina seguente:

Esperienza 2a: Semina di macrofagi J744

Manipolare colture cellulari in laboratorio significa utilizzare alcuni tipi di cellule per dimostrare l’effetto di determinati composti. In particolare nei laboratori di farmacologia sperimentale si utilizzano 2 tipi di cellule:

• colture primarie, cioè cellule isolate direttamente da un tessuto animale o umano in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro.
• linee cellulari continue, cioè cellule modificate in modo da essere in grado di replicarsi indefinitivamente. A questa categoria appartengono le cellule usate negli esperimenti, che sono facili da manipolare e permettono di ottenere risposte più riproducibili e con risultati meno variabili.

Le cellule possono crescere:

• in sospensione (quindi in mezzo fluido, senza aderire)
• aderenti alla superficie della piastra da coltura. È questo il caso dei macrofagi murini come quelli considerati nell’esperienza.

Le cellule utilizzate nell’esperienza sono macrofagi murini della linea J744, sono dunque cellule del sistema immunitario murino immortalizzate che crescono adese alla superficie del contenitore.

Materiale:

• flask: bottiglietta in plastica opportunamente trattata
• piastra ai 6 pozzetti
• pastori di plastica
• occhappe sterile (la sterilità degli strumenti è necessaria per minimizzare la contaminazione microbiologica, in quanto i microrganismi potrebbero competere con le cellule in coltura e potrebbero secernere sostanze tossiche, portando eventualmente alla morte cellulare)
• pipetta automatica P1000
• povine
• microscopio
• contacellule
• emicatorello
• incubatore (per il mantenimento di temperatura, % di CO₂ e umidità costanti)
• PBS
• DMEM + FBS 10%
• cellule (macrofagi J744)

Procedura:

1. Preparare la scala standard di BSA a partire da 100 μl di BSA 1 mg/ml nello St4 μg/μl BSA μl BSA μl NaOH μl H₂O Volume tot (μl) St4 1 100 50 0 100 St3 0,5 50 50 100 St2 0,25 50 50 100 St1 0,125 50 50 100 St0 0 50 50 100

   Utilizzando la pipetta automatica aggiungere ad ogni provetta (eccetto lo St0) 50 μl di H₂O. Applicare la tecnica delle diluizioni seriali trasferendo 50 μl da St4 fino ad arrivare a St1 (ad eccezione di St0). Aggiungere ad ogni provetta 50 μl di NaOH e verificare che il volume finale sia uguale in ogni provetta (100 μl).

2. Trasferire 100 μl di lisato cellulare nella provetta C (campione) con la pipetta automatica.
3. Preparare la soluzione A+B (50:1) con la pipetta automatica
   • Volume totale di A+B da preparare: 7000 μl
   • Volume di B: 7000 μl ÷ 51 = 137 μl
   • Volume di A: 137 μl × 50 = 6863 μl
   Unire i due volumi calcolati di A e B per ottenere la soluzione A+B.
4. Aggiungere 1 ml della soluzione A+B in ciascuna provetta mediante la pipetta automatica.
5. Incubare 10 minuti
6. Aggiungere 0,1 ml di Folin in ciascuna provetta mediante la pipetta automatica
7. Incubare 20 minuti