Paniere completo Biologia molecolare

1. SPIEGA LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA FACENDO UN CONFRONTO TRA

BATTERI ED EUCARIOTI Parallelamente per come avviene nei batteri, anche

negli eucarioti la ricombinazione omologa serve a riparare il DNA e a

recuperare le forche di replicazione bloccate. Negli eucarioti, tuttavia, essa ha

anche ulteriori importanti funzioni. E’ necessaria per un corretto appaiamento

dei cromosomi nelle divisioni mitotiche. Uno dei geni coinvolti in tale processo

è SPO11, il cui prodotto introduce nel DNA rotture a doppio filamento. La

proteina SPO11 ha una bassa specificità di sequenza, ma alta specificità

temporale. I siti di taglio di SPO11 sono siti caldi di ricombinazione. Il gruppo

ossidrile di una tirosina di SPO 11 attacca il DNA e forma un legame covalente

tra la proteina e l’acido nucleico. Le proteine Rad51 e Dmc1 sono omologhi di

RecA, in particolare Dmc1 viene espressa solo nelle cellule in meiosi, mentre

Rad51 sia nella mitosi che nella meiosi.

2. QUALI ESPERIMENTI HANNO CHIARITO LE ORIGINI DI REPLICAZIONE

MULTIPLA NEGLI EUCARIOTI? L’origine di replicazione è una sequenza di DNA

dalla quale comincia il processo di replicazione del DNA stesso, che contiene

brevi sequenze ripetute multiple. Tali sequenze vengono riconosciute e legate

da proteine multimeriche, le quali giocano un ruolo chiave nell’attivazione

dell’origine e nel successivo assemblaggio della DNA polimerasi. La specifica

struttura dell’origine di replicazione varia da specie a specie, ma conserva delle

caratteristiche comuni, come ad esempio un’elevata presenza di adenina e

timina. L’origine lega il complesso c.d. di pre replicazione, che il compito di

riconoscere l’origine, aprire il dna ed iniziare la replicazione. Le origini di

replicazione meglio studiate sono quelle relative ad un lievito, chiamato

Saccharomyces cerevisiae e sono state identificate per la loro capacità di

favorire la replicazione di plasmidi e mini cromosomi. Negli altri eucarioti le

origini di replicazione sono molto variabili, ciononostante, sono tutte in grado di

reclutare un set di proteine, meglio conosciute come complesso di pre

replicazione (pre-RC).

Lezione 022

1. Le principali differenze nei processi di replicazione e trascrizione sono la

trascrizione ha come prodotto molte copie di RNA, la duplicazione ha

come prodotto una copia del genoma che consiste in una molecola di

DNA.

2. In E coli, la cascata di eventi del mismatch repair INIZIA con i seguenti

eventi: MutS lega riconosce e lega il mismatch nel DNA, quindi lega una

ATP, cambia conformazione per formare una sliding clamp sul DNA, MutL

si lega MutS e quindi attiva Mut H

3. Nella RNA polimerasi di E.coli la subunità sigma70 media il legame della

polimerasi al promotore, riconoscendo le sequenze -10 e-35, attraverso il

dominio C terminale che riconosce il segmento UP del promotore

4. Qual'è l'elemento che agisce in trans (trans-dominante) nella regolazione

il repressore

5. La prima fase della riparazione per escissione di basi (BER), comune alle

due vie short-patch BER e long-patch BER, coinvolge in successione

l'attività di due enzimi, quali? DNA glicosilasi ed endonucleasi Ape1

6. Quale funzione viene alterata nella sindrome di Cockayne Riparazione del

danno ossidativo associato alla trascrizione

7. Qual'è la principale polimerasi coinvolta nella replicazine del DNA in

E.coli? DNA polimerasi III

8. Che cos'Ë un'unità di trascrizione? Una unit‡ di trascrizione Ë una

sequenza di DNA trascritta in un singolo RNA, che inizia da un promotore

e finisce ad un terminatore. L’enzima che catalizza la polimerizzazione

dell’RNA è l’RNA Polimerasi. L’RNA Polimerasi non richiede un innesco

come la DNA Polimerasi. L’RNA Polimerasi inizia la sintesi de novo a

partire da sequenze specializzate. La trascrizione Ë un processo che

avviene in tutte le cellule viventi. Durante la trascrizione, filamenti di

RNA vengono creati in base al DNA trovato all'interno delle cellule.

9. CHE COSA E’ LA TRASPOSIZIONE E CHE TIPI DI TRASPOSONI CONOSCI? La

trasposizione è una forma specifica di ricombinazione genetica che

sposta alcuni elementi genetici, chiamati trasposoni, da un sito ad un

altro. Lo spostamento avviene mediante un evento di ricombinazione tra

sequenze di DNA poste alle estremità dell’elemento trasponi bile ed una

presente sul DNA della cellula ospite. Esistono tre principali tipi di

trasposoni: i trasposoni a DNA, i retro trasposoni simili a virus, i retro

trasposoni poliA anche detti non virali.

10.CONFRONTA I SISTEMI DI RICOMBINAZIONE SITO SPECIFICA E LA

TRASPOSIZIONE: IN TERMINI DI MECCANISMI E MOLECOLE COINVOLTE

COSA HANNO IN COMUNE? La ricombinazione sito specifica e la

trasposizione sono due diversi tipi di ricombinazione. Nella prima gli

enzimi sono specifici per la sequenza; nella seconda le sequenze

vengono inserite senza bisogno di omologia di sequenza. Questi due

processi hanno in comune la ricombinasi e la formazione del complesso

sinaptico

Lezione 023

1. Quale funzione viene alterata nella sindrome di Cockayne Riparazione del

danno ossidativo associato alla trascrizione

2. Qual'è l'elemento che agisce in trans (trans-dominante) nella regolazione

il repressore

3. Qual'è la principale polimerasi coinvolta nella replicazione del DNA in

E.coli? DNA polimerasi III

4. Durante la replicazione della cromatina, la forca di replicazione

disassembla gli ottameri di istoni in tetrameri H32-H42 e in dimeri H2A-

H2B Durante la replicazione della cromatina, la forca di replicazione

disassembla gli ottameri di istoni in tetrameri H32-H42 e in dimeri H2A-

H2B. Sono necessarie alcune proteine ausiliare (tra cui CAF e NP1) che

favoriscono l'assemblaggio dei nucleosomi.

5. La prima fase della riparazione per escissione di basi (BER), comune alle

due vie short-patch BER e long-patch BER, coinvolge in successione

l'attività di due enzimi, quali? DNA glicosilasi ed endonucleasi Ape1

Lezione 024

1. Perchè mutazioni in BRCA2 sono responsabili del 50% di tumori al seno?

perchè la sua mancanza non permette una corretta riparazione del DNA

2. Qual'è la proteina centrale della ricombinazione omologa RecA che è il

prototipo di una classe di proteine presenti in tutti gli organismi

3. I meccanismi di riparazione sono specifici per tipo di errore e

funzionalmente conservat. La riparazione diretta del danno avviene

tramite fotoriattivazione e trans metilazione

4. Il DNA viene danneggiato sia per cause endogene che per cause

esogene. Gli errori sono dati in maggior parte da agenti mutageni

endogeni, quindi il DNA è danneggiato in condizioni fisiologiche da

acqua, ossigeno e agenti alchilant

5. Gli agenti alchilanti sono sostanze che sono composti elettrofili con

affinità per gli atomi nucleofili delle basi a cui aggiungono gruppi metilici

o etilici

6. Nel caso del long-patch BER negli eucarioti, le attività di tre proteine,

oltre alla ligasi finale, provvedono ad allungare di alcuni nucleotidi il

3'OH e a tagliare via il tratto di DNA spostato. Di quali proteine si tratta?

PCNA

7. Le sequenze ripetute nell'origine di replicazione (OriC) del cromosoma di

E.coli vengono legate da una proteina che forma un grosso multimero

associato all'Origine stessa. Di che proteina si tratta? DnaA

Lezione 025

1. In questa rappresentazione schematica di un classico promotore

procariotico, identifica gli elementi A, B e C e la distanza D. fig 9.1 A:

Elemento -35, B: Elemento -10 (Pribnow box), C: Sito di inizio della

trascrizione, D: 17-19 pb

2. . La figura rappresenta 8.1 RNA polimerasi batterica

3. Relativamente al seguente tratto di una molecola di RNA, quale è la

sequenza del filamento "stampo" del DNA? 5'-

UACGCGGUACGGUCAAUGCAUCUACCU-3' 3'-

ATGCGCCATGCCAGTTACGTAGATGGA-5'

4. Identifica correttamente le subunità dell'enzima nell'immagine fig 8.1

1.b, 2.b',3.a,4.a,5.omega

5. . CHE COSA SIGNIFICA EMSA? A COSA SERVE E COME VIENE ESEGUITA?

L’Electrophoresis Mobility Shift Assay è un test nel quale il saggio

determina se è avvenuto il legame tra una sequenza di DNA e una

proteina. Si basa sul fatto che il DNA a cui vengono legate le proteine

migra più lentamente in elettroforesi su gel di poliacrilamide non

denaturante. Il DNA può essere incubato sia con proteine purificate che

con estratti nucleari. In quest’ultimo caso vanno caratterizzate le

proteine legate tramite anticorpi. Il vantaggio di questo processo è che

è veloce, semplice e sensibile. In sintesi, questa procedura può

determinare se una proteina è in grado di loegarsi ad una specifica

sequenza di DNA o RNA e, talvolta, indica se più di una molecola

proteica è coinvolta nel complesso di legame.

LEZIONE 026

1. DESCRIVI I TRE PASSAGGI DELL’INIZIO DELLA TRASCRIZIONE E LE

FUNZIONI DI CORREZIONE DI BOZZE DELLA RNA POLIMERASI

BATTERICA. La trascrizione dell’RNA avviene secondo tre fasi: inizio,

allungamento del filamento e terminazione. L’inizio avviene dopo che

specifici fattori trascrizionali presenti sulle sequenze di DNA e sulla DNA

polimerasi interagiscono tra si loro mediante riconoscimento di

reciproche sequenze. In conseguenza di ciò si verifica l’apertura del

filamento di DNA in corrispondenza del promotore. Lapertura del sito

promotore rende possibile l’avvio della sintesi di RNA. Nel momento in

cui il DNA si apre, viene a formarsi la c.d. bolla di trascrizione. L’RNA

polimerasi procede con un’elevsta processività fino alla sequenza di

stop. Quest’ultima codifica per una regione di RNA che contiene una

lung sequenza palindroma per via della quale l’RNA si ripiega a formare

una forcina. Tale struttura determina il distacco del filamento di RNA

dallo stampo di DNA, la chiusura della bolla e il riavvolgimento del DNA.

Durante la fase di allungamento, la RNA polimerasi si blocca e crea dei

processi inattivi, talvolta a causa degli errori che incontra. Essa dunque

ha anche una funzione di editing, che può essere idrolitico (o

autocorrezione nucleo litica) o pirofosforolitico (o autocorrezione

cinetica). Nel primo caso la polimerasi torna indietro di uno o più

nucleotidi, apre per un tratto l’ibrido DNA-RNA e rimuove i ribonucleotidi

del tratto aperto. Nel secondo caso invece, l’enzima si blocca per

l’errore, inverte la reazione e reincorpora il pirofosfato, lasciando

staccare il ribonucleotide.

LEZIONE 028

1. CHE COSA E’ IL QUORUM SENSING? E’ un sistema di regolazione

trascrizionale dipendente dalla densità cellulare, ossia un meccanismo

che molte cellule batteriche della stessa specie