Paniere Biologia molecolare

2. QUALI SONO LE ATTIVITA’ BIOCHIMICHE RELATE ALLA RICOMBINAZIONE

DELLA PROTEINA RecA? La proteina RecA è il prototipo di una classe di

proteine presenti in tutti gli organismi. Essa interagisce con RecBCD

sostituendosi sul singolo filamento alle proteine SSB. E’ il membro

centrale di una famiglia di enzimi con la funzione di scambiare il

filamento, che catalizzano la ricerca di sequenze complementari tra gli

omologhi ed il loro appaiamento. La forma attiva di RecA è un enorme

filamento nucleo proteico di dimensioni variabili. Differentemente da

quasi tutte le altre proteine, RecA è formata da un numero molto elevato

di sub unità e possono contenere da uno a 4 filamenti di DNA. Il legame

delle sub unità di RecA è cooperativo ed il suo sub strato preferito è il

single stranded DNA. In seguito al legame la doppia elica è più estesa in

una molecola di ssDNA oppure di una molecola di double strand normale.

Lezione 020

1. Come funziona la nick translation? la DNA polimerasi I si lega ad

un'estremità 3'OH libera in seguito ad un'interruzione del DNA, e

digerisce nucleotidi nella direzione 5'-3'

2. Il test di Ames è utilizzato per stabilire l'eventuale effetto mutageno di

una sostanza chimica.L'effetto mutageno è potenzialmente cancerogeno

nell'uomo. Il test utilizza un ceppo di S. typhimurium mutato negli enzimi

della sintesi dell'istidina. Se l'aggiunta della sostanza mutagene provoca

mutazioni proprio sugli enzimi della sintesi dell'istidina del ceppo di S.

typhimurium utilizzato, si potrà avere una reversione del danno con

conseguente crescita di colonie batteriche sul terreno selettivo. Il test è

altamente specifico

3. Qual è il danno più comune dell'idrolisi sul DNA? deaminazione della

citosina ad uracile

4. se la lesione del DNA lascia un gap su un filamento e viene a mancare lo

stampo si verifica un'invasione da parte del filamento danneggiato, si

genera una migrazione delle due giunzioni di Holliday, rotte da una

resolvasi . Si utilizza il filamento inatto come stampo

5. Una mutazione nel gene RuvB potrebbe aumentare gli eventi di

ricombinazione del DNA

6. Il complesso proteico detto caricatore della sliding clamp catalizza

l'apertura ed il posizionamento della proteina sul DNA, allo stesso modo il

caricatore rimuove la sliding clamp quando la sintesi del DNA è finita. Il

caricatore è ATP dipendente, quando il caricatore si lega, le subunità ?

e ? cambiano conformazione e possono in questo interagire con la pinza

e determinarne l'apertura.

7. cos'è la nick translation? è una tecnica molto utilizzata in biologia

molecolare, che si avvale della proprietà dell'enzima klenow di spostare il

taglio, generato dalla sua proprietà esonucleasica 5'-3' e5'-3'

polimerasica

8. . Ognuno dei subcomplessi catalitici della DNA polimerasi III si assembla

sul DNA grazie ad un altro subcomplesso, ?, principale organizzatore

dell'oloenzima, complesso ? appartiene alla famiglia delle proteine AAA+

(ATPasi Associate a varie Attività) che utilizzano l'energia dell'idrolisi

dell'ATP. Si possono classificare come ATPasi DNA dipendenti

9. Perchè ciascuna forca replicativa richiede un filamento guida ed un

filamento ritardato? perchè i filamenti del DNA sono antiparalleli e la

polimerasi può lavorare solo in una direzion

10.In E.coli, la riparazione di un DSB (rottura a doppio filamento) mediante

HR (ricombinazione omologa) dipende dalle ttività elicasica e nucleasica

del complesso RecBCD . Questo degrada un filamento del DNA dalla sua

estremità 3' fino a che incontra una particolare sequenza chiamata

SOSbox , dopodichè degrada l'altro filamento generando alla fine un

tratto di DNA sporgente in 3' a cui si lega la proteina RecA . Questa

innesca i successivi passaggi ricombinativi.

11.. Le cause endogene del danno al DNA Sono più frequenti delle cause

esogene. Si dividono in errori delle replicazione, della ricombinazione,

instabilità chimica del DNA, prodotti del metabolismo cellulare

12.. in E. coli la DNA polimerasi I Riempire le brevi sequenze di DNA a

singola elica che derivano dalla replicazione del DNA (lagging strand) e

dalla riparazione, quando i nucleotidi danneggiati devono essere rimossi

13.Considera una giunzione di Holliday: Quali sono i due modi in cui puÚ

essere risolta per generare due doppie eliche indipendenti? Prova a

disegnare il meccanismo. Una riparazione di un double-strand-break O

DSB efficace richiede una fonte non danneggiata per duplicare

l'informazione genetica come, per esempio, il DNA a doppia elica dei

cromosomi omologhi. la riparazione procede in modo che la terminazione

rotte sono processate prima per creare un'estensione a singolo filamento

al 3’ e vengono utilizzate per l'invasione del filamento degli omologhi. le

estremità 3’ invadono sono estese della DNA polimerasi. Il Crossover Ë

detto giunzione di Holiday. nucleasi specializzati riconoscono e si

attaccano Atari giunzioni in due modi possibili in modo che i prodotti

siano cromosomi con un set completo di geni punto la risoluzione della

giunzione di Holliday si verifica tagliando i filamenti di DNA vicino al sito

di incrocio punto i due filamenti con le stesse sequenze polarit‡ devono

essere chi va Ti in due modi alternativi: - il taglio si verifica su filamenti di

DNA che non sono stati rotti durante la reazione di iniziazione o DNA

parentale, le molecole risultanti hanno una porzione a doppio filamento

in cui regioni originali sono unite a Zone ibride si verifica pertanto un

riassortimento dei geni o prodotto di Crossover. - il taglio si verifica su

filamenti con combinazione mista di sequenza di entrambe le molecole

parentali senza un vero scambio tranne la zona in cui i due filamenti di

DNA sono stati rotti per iniziare la ricombinazione. Queste molecole sono

prodotte patch, non vi Ë riassortimento dei geni adiacenti il sito di

clivaggio ovvero prodotti di non Crossover.

14.DESCRIVI IL RUOLO DI RuvA e RuvB NEL PROMUOVERE LA MIGRAZIONE

DEL BRANCHING. E’ un complesso che riconosce specificamente la

giunione di Holliday e promuove la migrazione del chiasma. La velocità

naturale della migrazione di una giunzione di Holliday è molto lenta.

Come osservato anche in E.Coli, RuvA e RuvB funzionano come dei

motori che accelerano tale migrazione. Questo è un processo ATP

dipendente. La proteina RuvA lega specificamente la giunzione di

Holliday in modo sequenza dipendente, mentre la proteina RuvB, che è

una ATPasi esamerica, fornisce l’energia per lo scambio appaiamento e

movimento del chiasma.

LEZIONE 021

1. SPIEGA LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA FACENDO UN CONFRONTO TRA

BATTERI ED EUCARIOTI Parallelamente per come avviene nei batteri, anche

negli eucarioti la ricombinazione omologa serve a riparare il DNA e a

recuperare le forche di replicazione bloccate. Negli eucarioti, tuttavia, essa ha

anche ulteriori importanti funzioni. E’ necessaria per un corretto appaiamento

dei cromosomi nelle divisioni mitotiche. Uno dei geni coinvolti in tale processo

è SPO11, il cui prodotto introduce nel DNA rotture a doppio filamento. La

proteina SPO11 ha una bassa specificità di sequenza, ma alta specificità

temporale. I siti di taglio di SPO11 sono siti caldi di ricombinazione. Il gruppo

ossidrile di una tirosina di SPO 11 attacca il DNA e forma un legame covalente

tra la proteina e l’acido nucleico. Le proteine Rad51 e Dmc1 sono omologhi di

RecA, in particolare Dmc1 viene espressa solo nelle cellule in meiosi, mentre

Rad51 sia nella mitosi che nella meiosi.

2. QUALI ESPERIMENTI HANNO CHIARITO LE ORIGINI DI REPLICAZIONE

MULTIPLA NEGLI EUCARIOTI? L’origine di replicazione è una sequenza di DNA

dalla quale comincia il processo di replicazione del DNA stesso, che contiene

brevi sequenze ripetute multiple. Tali sequenze vengono riconosciute e legate

da proteine multimeriche, le quali giocano un ruolo chiave nell’attivazione

dell’origine e nel successivo assemblaggio della DNA polimerasi. La specifica

struttura dell’origine di replicazione varia da specie a specie, ma conserva delle

caratteristiche comuni, come ad esempio un’elevata presenza di adenina e

timina. L’origine lega il complesso c.d. di pre replicazione, che il compito di

riconoscere l’origine, aprire il dna ed iniziare la replicazione. Le origini di

replicazione meglio studiate sono quelle relative ad un lievito, chiamato

Saccharomyces cerevisiae e sono state identificate per la loro capacità di

favorire la replicazione di plasmidi e mini cromosomi. Negli altri eucarioti le

origini di replicazione sono molto variabili, ciononostante, sono tutte in grado di

reclutare un set di proteine, meglio conosciute come complesso di pre

replicazione (pre-RC).

Lezione 022

1. Le principali differenze nei processi di replicazione e trascrizione sono la

trascrizione ha come prodotto molte copie di RNA, la duplicazione ha

come prodotto una copia del genoma che consiste in una molecola di

DNA.

2. In E coli, la cascata di eventi del mismatch repair INIZIA con i seguenti

eventi: MutS lega riconosce e lega il mismatch nel DNA, quindi lega una

ATP, cambia conformazione per formare una sliding clamp sul DNA, MutL

si lega MutS e quindi attiva Mut H

3. Nella RNA polimerasi di E.coli la subunità sigma70 media il legame della

polimerasi al promotore, riconoscendo le sequenze -10 e-35, attraverso il

dominio C terminale che riconosce il segmento UP del promotore

4. Qual'è l'elemento che agisce in trans (trans-dominante) nella regolazione

il repressore

5. La prima fase della riparazione per escissione di basi (BER), comune alle

due vie short-patch BER e long-patch BER, coinvolge in successione

l'attività di due enzimi, quali? DNA glicosilasi ed endonucleasi Ape1

6. Quale funzione viene alterata nella sindrome di Cockayne Riparazione del

danno ossidativo associato alla trascrizione

7. Qual'è la principale polimerasi coinvolta nella replicazine del DNA in

E.coli? DNA polimerasi III

8. Che cos'Ë un'unità di trascrizione? Una unit‡ di trascrizione Ë una

sequenza di DNA trascritta in un singolo RNA, che inizia da un promotore

e finisce ad un terminatore. L’enzima che catalizza la polimerizzazione

dell’RNA è l’RNA Polimerasi. L’RNA Polimerasi non richiede un innesco

come la DNA Polimerasi. L’RNA Polimerasi inizia la sintesi de novo a

partire da sequenze specializzate. La trascrizione Ë un processo che

avviene in tutte le cellule viventi. Durante la trascrizione, filamenti di

RNA vengono creati in base al DNA trov