Relazione di laboratorio

Come si usa il microscopio? ●​ filtrazione:

1.​ accendere la luce; -​ filtri millipore:

2.​ porre il vetrino sul si utilizza per le sostanze che

tavolino traslatore, non possono essere

sistemare il preparato sterilizzate a caldo (zuccheri,

rivolto verso l’alto e in latte, vitamine), si usano filtri

prossimità dell’apertura porosi di acetato di cellulosa,

centrale del tavolino; capaci di trattenere i batteri di

3.​ avvicinare il tavolino grandezza superiore ai loro

all’obiettivo più piccolo pori.

(4x) mediante la vite -​ membrane filtranti:

macrometrica; per filtrare campioni liquidi, al fine di

4.​ mettere a fuoco con la trattenere i batteri in esso presenti, si

vite micrometrica; utilizzano opportune membrane con l’apposito

5.​ regolare l’intensità apparato di filtrazione.

della luce;

6.​ regolare l’apertura del

diaframma

considerando che con

l’obiettivo 100x il

diaframma deve avere

la massima apertura;

7.​ spostare il preparato sul

tavolino mediante il

sistema di viti poste al

di sotto di esso;

8.​ individuare un buon

campo e quindi ruotare

l’obiettivo successivo

(10x) e passare poi al

40x mantenendo

sempre il fuoco;

9.​ abbassare leggermente

il tavolino traslatore,

mettere una goccia di

olio da immersione al

centro del vetrino,

abbassare l’obiettivo

100x con cautela verso

la goccia e mettere a

fuoco;

10.​ descrivere quanto

osservato.

PROCEDIMENTO

●​ Campionamento

Non sempre l’alterazione e la degradazione sono causate dalla presenza di microrganismi infatti la

correlazione va provata. Dopo il sopralluogo, il campionamento è la prima fase dell’analisi. Esistono

diverse tecniche di campionamento e la scelta di utilizzo deve essere valutata a seconda del tipo, della

morfologia, nonché dello stato di conservazione del materiale oggetto di studio. Si deve sempre tenere

conto del fatto che il campionamento determina il tipo di indagini che possono essere successivamente

condotte.

L’attività è stata condotta mediante dei campioni di stoccaggio precedentemente esaminati, dunque si

salta la parte di campionamento.

●​ Preparazione del terreno

Le fasi della preparazione dei terreni di coltura prevedono la scelta dei componenti e la loro

solubilizzazione, sterilizzazione e conservazione. Generalmente si impiegano terreni di coltura

disidratati che già contengono i singoli ingredienti nelle proporzioni desiderate, altre volte si ricorre

alla pesatura dei singoli ingredienti. Nel caso dei terreni commerciali, sull'etichetta di ogni confezione

sono riportate, tra le altre, le seguenti importanti informazioni:

a) ingredienti,

b) data di scadenza,

c) numero del lotto (fondamentale per la riproducibilità delle caratteristiche),

d) modalità di preparazione.

I terreni di coltura microbici devono fornire condizioni di crescita ottimali per tutti i microrganismi o

per alcuni di loro. La composizione precisa di un terreno dipende dalla specie coltivata e dagli

obiettivi prefissi. Il pH del terreno deve essere regolato in funzione del microrganismo. I terreni di

coltura microbiologici vengono classificati in base a diversi parametri, come costituenti chimici,

natura fisica e funzione.

Prima di procedere occorre preparare i terreni sciogliendo la polvere in acqua distillata. Si utilizzano i

terreni RBC per i funghi e PCA per i batteri.

Per la preparazione dei terreni da formulazioni commerciali disidratate è necessario seguire le

istruzioni del produttore. Per proteggere i terreni di coltura dall'infezione microbica è essenziale che le

fasi di preparazione e la conservazione avvengano in condizioni di sterilità.

L’adeguata quantità di terreno disidratato o i singoli ingredienti vanno sciolti in acqua distillata

mediante agitazione continua seguita da riscaldamento (se necessario).

1)​ Pesare accuratamente in una beuta la quantità desiderata.

Va posta particolare attenzione a maneggiare con cura le confezioni e le spatole: molti terreni

disidratati contengono polveri finissime (quasi impalpabili) che possono essere inalate con

facilità (in alcuni laboratori è fatto obbligo ai tecnici di indossare mascherine protettive).

2)​ Aggiungere un volume di acqua distillata pari alla metà della quantità richiesta.

3)​ Agitare fino a completa dissoluzione degli ingredienti e portare a volume avendo cura di non

lasciare tracce di terreno non disciolto sulle pareti della beuta.

Dopo avere regolato il pH, il terreno viene dispensato nei contenitori appropriati e sterilizzato

mediante calore umido in autoclave. Le sostanze termosensibili (ad es. proteine, enzimi) vengono

invece sterilizzate mediante filtrazione su membrana.

●​ Preparazione della soluzione fisiologica

Si sciolgono 0,9 g di NaCl in 100 mL di acqua distillata utilizzando una beuta. Dopo aver disciolto

completamente il cloruro di sodio servendosi, se opportuno, di un agitatore magnetico, si trasferiscono

9 mL di soluzione fisiologica in 10 provette di ugual misura.

●​ Sterilizzazione in autoclave

A questo punto di può inserire il tutto in un cestello per eseguire l'autoclavaggio dei

terreni, della soluzione fisiologica e di tutti i materiali che necessitano di condizioni

sterili per l’utilizzo.

●​ Diluizioni seriali

Il conteggio delle colonie in una piastra inoculata anche con solo 1 mL di campione

potrebbe risultare impossibile. Per questo motivo, al fine di determinare la carica

microbica vitale del campione, il primo passaggio consiste nell’eseguire delle diluizioni seriali.

Si tratta di diluizioni eseguite in serie e in cui si parte da una soluzione iniziale, nel nostro caso il

recipiente contenente il campione di cui si vuole stimare la carica microbica.

Si procede in questo modo, riducendo la carica progressivamente fino ad esaurire le provette

precedentemente sterilizzate in autoclave. Occorre vortexare brevemente la provetta prima di

prelevare la quantità da trasferire alla provetta successiva e bisogna eseguire tutte le operazioni

seguendo la tecnica di asetticità ricordandosi di cambiare ogni volta la pipetta ad ogni trasferimento.

●​ Distribuzione del terreno in piastre petri

Nel determinare il quantitativo di piastre e provette da approntare, va tenuto conto dei limiti di tempo

entro i quali è possibile usare il prodotto. Per ogni terreno vanno osservate delle indicazioni e qualora

fosse necessario tenere incubati i terreni nel termostato. Nel momento in cui è necessario, mantenendo

condizioni asettiche si versa il terreno nelle piastre petri sterili. Il rovesciamento è importante perché

impedisce che la "condensa", che si forma dal vapore del terreno in raffreddamento, si aggreghi in

goccioline che potrebbero cadere sul terreno alterando eventuali colonie fatte crescere su di esso.

È sempre opportuno siglare le piastre a seconda dell’impiego.

●​ Semina dei microrganismi nel terreno di coltura

Seguendo la tecnica di asetticità, la semina in piastra può essere svolta seguendo due modalità:

1.​ metodo dello spatolamento, per studiare la carica fungina, consiste nel deporre al centro del

terreno RBC già solidificato in piastra, una goccia di sospensione microbica, il volume è

variabile in base alla concentrazione dei microrganismi presenti sul campione, generalmente

si impiegano 0,1 mL; la sospensione viene quindi distribuita sull’intera superficie del terreno

mediante una bacchetta monouso sterile a forma di “L” che viene mossa avanti e indietro e

contemporaneamente fatta ruotare, ciò permette la distribuzione delle singole cellule e quindi

il conteggio delle colonie risalendo al numero di microrganismi presenti al volume di inoculo

in base al principio che ogni colonia si origina da un singolo microrganismo;

2.​ metodo dell’inclusione, usato per studiare la carica batterica, anche questo metodo si applica

quando le cellule microbiche sono sospese in un mezzo liquido; una volta preparato il terreno

colturale, questo viene tenuto termostatato a circa 55 °C in modo tale che non si solidifichi

per effetto del raffreddamento; essa comporta l’uso di pipette graduate sterili che consentano

il trasferimento di volumi precisi di liquidi nelle piastre petri a loro volta vuote e sterili;

partendo dall’ultima diluizione e andando a ritroso, si trasferisce all’interno della piastra 1 mL

della diluizione corrispondente in condizioni asettiche (in questo caso non serve cambiare

ogni volta le pipette, ma è sempre utile avere l’accortezza di cambiarle ogni 2 o 3 diluizioni);

una volta trasferito ciascun mL in piastra, si versa all’interno il terreno colturale PCA (18-20

mL) avendo cura nel mantenere la asetticità e agitando leggermente la piastra contenente la

liquida della soluzione e il terreno PCA per rendere così omogeneo il contenuto; una volta

raffreddati, l'agar si solidifica e le piastre possono essere capovolte in modo tale che la

condensa rimanga sul coperchio della piastra.

●​ Incubazione delle piastre

Le piastre contenenti i terreni colturali PCA e RBC andranno termostatate a 30°C e 25°C

rispettivamente e monitorate fino alla comparsa delle colonie.

N.B.

Finita l’attività di laboratorio il bancone va riordinato e

lasciato come lo si ha trovato, le provette usate per eseguire

le diluizioni vanno svuotate nel lavello e si rimuove la sigla.

Il portaprovette va riportato sul bancone del laboratorio.

●​ Conta delle colonie ed espressione della carica

Le piastre vanno messe in ordine sul bancone per procedere

a diluizioni seriali e piastramenti. Si individua la piastra che

corrisponde alla prima diluizione leggibile con delle colonie

distinguibili e sufficientemente separate fra loro. Per

contare le colonie in piastra, basta osservare il fondo in

controluce e con un pennarello indelebile mettere un segno

in corrispondenza di ogni colonia. Bisogna sempre

rapportare le conte alla prima diluizione leggibile per poi

fare la media riferita ad essa e ricordandosi della quantità di

campione impiegato a seconda che la semina sia avvenuta

per inclusione o per spatolamento.

●​ Conta diretta con microscopio Esiste un altro metodo di conta che non impone una

coltura dei microrganismi, ma può essere eseguita

direttamente su un volume noto di campione. Si

utilizzano le cosiddette camere di Thoma o di Burker, il

vetrino di superficie è inciso con un reticolo quadrettato

di cui è nota l’area di ogni riquadro. Dato che lo spessore

tra il reticolo e il vetrino coprioggetto è noto, è possibile

determinare il volume di sospensione batterica contenuta

in ogni riquadro. Questo metodo ha un limite in quanto

non è possibile