Esercizi tecnologia del DNA

Equivalenze fra unità di misura

Pesog    mg    μg    ng    pgVolumel    ml    μl    nl    pl

10 g = μg?    10 g = 10 x 10⁶ μg3 ng = μg?    3 ng = 3 10^-3 μg5 ng = pg?    5 ng = 5 10³ pg

Concentrazione = Peso / Volume

40 mg/ml = μg/ml?    = μg/μl?

40 mg/ml = 40 10³ μg/ml = 40 10³ μg/10³ μl = 40 μg/μl

3 ng/μl = μg/μl?    = μg/ml?

3 ng/μl   = 3 10^-3 μg/μl   = 3 10^-3 μg/10^-3 ml = 3 μg/ml

0.5 pg/μl = μg/ml?

0.5 pg/μl = 0.5 10^-6 μg/μl = 0.5 10^-6 μg/10^-3 ml= 0.5 10^-3 μg/ml

Una soluzione di un DNA di 300 pb ha una concentrazione di 15 μg/μl. Qual è la sua concentrazione molare?

PM medio di una coppia di basi è 660 Da

Quantità in moli = Peso (g) / Peso Molecolare (Da)

PM (300bp) = 300 x 660 Da = 198000 Da = 198 kDa

μmoli del DNA da 300bp = 15 μg / 198000 = 7.6 10^-5

15 μg/μl corrisponde per questo DNA a 7.6 10^-5 μmoli/μl

Trasformata in Molarità cioè moli/litro

7.6 10^-5 μmoli = 7.6 10^-5 x 10^-6 moli = 7.6 10^-11 moli

7.6 10^-5 μmoli/μl = 7.6 10^-11 moli / 10^-6 l

Una soluzione di un DNA di 300 pb ha una concentrazione di 15 μg/μl. Quante molecole di questo DNA sono contenute in 5 μl di tale soluzione

• Concentrazione = Peso / Volume
• Peso = Conc. x Vol.
• Peso = 15 μg/μl x 5 μl = 75 μg

Quantità in moli = Peso / Peso Molecolare

• PM (300bp) = 300 x 660 Da = 198000 Da = 198 kDa
• μmol di DNA da 300bp = 75 μg / 198000 = 3.8 x 10^-4

Numero di Avogadro: 1 mole contiene 6.022 x 10²³ molecole

• 3.8 10^-4 μmol = 3.8 10^-4 x 10^-6 moli = 3.8 10^-10 moli
• 3.8 10^-10 moli x 6.022 x 10²³ molecole/mole = 2.29 x 10¹⁴ molecole

5 μl di tale soluzione contengono 2.29 x 10¹⁴ molecole di DNA

Quanti tipi di molecole si formano dopo digestione di una molecola di DNA circolare contenente due siti di restrizione?

Enzima di restrizione EcoRI (GAATTC)

L’efficienza di restrizione non è mai al 100%

Determinazione della quantità in peso del frammento di DNA genomico contenente il gene della β-globina estraibile da 1 litro di batteri nei quali è stato clonato tale DNA (a livello di un vettore batterico ad alto numero di copie: 200)

1 litro di coltura batterica di E. coli ci sono 10¹² cellule

Se il DNA del gene della β-globina umana viene inserito in un vettore batterico che raggiunge 200 copie per cellula:

N° totale di molecole contenute in 1 litro = 10¹² x 200 = 2 x 10¹⁴

moli di DNA del gene della β-globina = 2 x 10¹⁴ / 6.02 x 10²³ = 3.3 x 10^-10 moli

= 3.3 x 10^-4 μmoli

μg di DNA gene della β-globina = 3.3 x 10^-4 μmoli x PM_{gene della β-globina}

= 3.3 x 10^-4 x 1.32 x 10⁶ Da = 4.2 x 10^-2 = 420 μg

42 μg

420 μg

Domanda:

Quanti cloni devo produrre (e analizzare) per avere la certezza di isolare qualunque cDNA? Ovvero quale deve essere la complessità della mia libreria?

Es: 12'000 differenti mRNA sono poco abbondanti (es. 10 copie per cellula).

Il numero minimo n di cloni di cDNA necessario per rappresentare completamente l'mRNA di questa classe poco abbondante (perché almeno un clone per ogni specie di mRNA) sarà:

n = 200'000 (numero totale medio di molecole/cellula) / 10 = 20'000

Il numero N di ricombinanti da isolare (e analizzare), per avere una certa probabilità P che il clone desiderato sia rappresentato nella libreria è dato dalla formula vista per le librerie genomiche:

N = ^{ln (1 - P)} / _{ln (1 – 1/n)}

Es. Se P = 99%, allora per una libreria di cDNA dovrà avere la dimensione:

N = ^{ln (1-0.99)} / _{ln (1 – 1/ 20'000)} = 100'000 cloni

Molti mRNA sono presenti nella cellula ad un livello più basso di quello considerato (anche solamente 1 molecola per cellula).

Per isolare il clone desiderato, spesso è necessario:

• Creare librerie a cDNA costituite da diversi milioni di cloni indipendenti.
• Vagliare diversi milioni di cloni di cDNA.

15 = Numero totale colori

Quante perle N devo prelevare dal contenitore per avere la probabilità P di prendere tutti i colori (anche gli 11 più rari)?

Numero minimo di perle: 100/2= 50 perle

Es. Se P = 99%,

N = ^{ln (1- 0.99)} / _{ln (1 – 1/ 50)} = 228 perle

La complessità di una libreria a cDNA dipende:

• Numero di molecole di mRNA prodotte per cellula
• Dalla frequenza degli mRNA più rari
• Dalla probabilità che vogliamo che la libreria contenga tutti i cDNA