Domande Biochimica Applicata - De Filippis

OPPURE

Lo Shock Osmotico è un metodo non meccanico per la lisi cellulare applicabile preferibilmente a

cellule prive di parete cellulare. Le cellule vengono aggiunte a una soluzione ipertonica di

saccarosio (20% p/v). Il saccarosio, attraverso opportuni trasportatori, viene importato all’interno

della cellula in modo che il citoplasma raggiunga una condizione di ipertonicità che porterà

inevitabilmente a un richiamo di acqua all’interno della cellula, gonfiandola. Dal punto di vista

pratico si inserisce la cellula nella soluzione ipertonica di saccarosio per favorire l’assorbimento.

Successivamente le cellule vengono trasferite in una soluzione ipotonica (riferita alla pressione

osmotica plasmatica) e, in questo caso, la condizione ipertonica del citoplasma richiamerà acqua

dall’esterno verso l’interno della cellula. Si ha il rigonfiamento della cellula che porta alla sua morte

per rottura della membrana. Questo metodo ci consente di lisare solamente la membrana plasmatica

e non gli organelli cellulari. È un modo per rompere in maniera selettiva la membrana lasciando

integri gli organelli sub-cellulari come il nucleo e i mitocondri.

25. Precipitazione frazionata delle proteine: effetto della forza ionica.

Uno dei metodi utilizzati per la precipitazione frazionata delle proteine è quello di sfruttare la

differente solubilità delle proteine in funzione della Forza Ionica, la quale è definita come:

Fi= Σ ½ Ci * Zi^2. I fenomeni che si verificano possono essere di Salting In o di Salting Out.

Solitamente la dipendenza della solubilità della proteina in funzione della Forza Ionica ha un

andamento di tipo parabolico per un certo valore di pH, questo indica che per bassi o elevati valori

di Forza Ionica la proteina è poco solubile mentre per livelli intermedi si ha il massimo della

solubilità.

-A bassa Forza Ionica (sotto i 50 mM) il macroione proteico presenta un guscio di solvatazione

un’interazione molto forte di tipo carica-caria

poco spesso, si ha tra la carica della proteina e la

carica dello ione posizionato sul guscio di solvatazione e quindi gli effetti di schermatura dei gusci

di solvatazione sono di piccola entità. Di conseguenza il campo elettrico generato dalla proteina

sarà elevato e quindi sarà favorita l’interazione tra le proteine presenti nell’estratto grezzo, o tra

zone differenti della stessa proteina, che andranno a formare degli aggregati che precipiteranno nel

momento in cui non vengono adeguatamente solvatati.

-A elevata Forza Ionica (almeno 300 mM) sono presenti elevate concentrazioni di ioni positivi e

negativi che necessitano di essere solvatati, quindi si verifica una perdita di molecole di acqua che

solvatare le proteine, si avrà quindi una diminuzione dell’attività

non saranno più disponibili a

dell’acqua ovvero della sua concentrazione efficace. A questo punto il sistema cerca di stabilizzarsi

minimizzando il rapporto tra la superficie e il volume, questo comporta l’aggregazione della

proteina che di conseguenza precipita.

-A concentrazioni intermedie abbiamo un effetto di schermatura delle cariche che tengono le

proteine separate e allo stesso tempo, la concentrazione salina non è così elevata da andare a

sequestrare le molecole di acqua.

26. Precipitazione frazionata delle proteine: effetto del pH.

La precipitazione frazionata è uno dei metodi più utilizzati per concentrare l’estratto grezzo e quindi

contribuire alla sua purificazione. In particolare, questo processo sfrutta la differente solubilità delle

proteine contenute nell’estratto basandosi su differenti parametri, che sono la variazione di pH,

della temperatura, della forza ionica e l’aggiunta di cosolventi organici. Nel caso particolare del pH,

si opera la precipitazione al pI: il punto isoelettrico corrisponde al pH al quale si ha un equilibrio tra

cariche positive e negative, con carica netta pari a 0. Abbiamo quindi tre situazioni. Nel caso in cui

pH>pI, la superficie della proteina avrà densità di carica prevalentemente negativa, che comporta

repulsione tra le diverse proteine; allo stesso modo, se pH<pI, si avrà repulsione elettrostatica delle

proteine in quanto queste presenteranno densità di carica prevalentemente positiva. Nel caso in cui

pH=pI, la carica netta della proteina è nulla e quindi saranno favoriti gli effetti di attrazione e

conseguente aggregazione delle varie proteine, effetti che stabilizzano il sistema, ma allo stesso

tempo comportano la formazione di aggregati di dimensioni tali da non essere più solubili

nell’estratto, con conseguente precipitazione del materiale, che verrà separato per centrifugazione o

decantazione. Possiamo quindi operare andando a precipitare la proteina di interesse oppure

favorendo la coprecipitazione di proteine di scarto, mantenendo la proteina di interesse in soluzione.

Il pH ha un ruolo importante anche nella precipitazione in funzione della forza ionica, ossia

nell’effetto di Salting In (aumento della solubilità della proteina, generalmente a valori intermedi di

forza ionica) e Salting Out (diminuzione della solubilità della proteina per valori molto bassi o

elevati di forza ionica): come abbiamo già detto, al variare del pH varia lo stato di carica della

proteina e quindi varia anche l’effetto dei sali sulla solubilità della stessa rispetto alla solubilità dei

contaminanti.

27. Materiali usati nel processo di filtrazione.

La filtrazione ci permette di separare il surnatante e il precipitato che si trova sospeso in esso.

Il sistema di filtrazione normalmente utilizzati si basano sul sottovuoto, in cui viene posto un

imbuto di vetro, con un filtro intercambiabile, su una beuta collegata ad una pompa a vuoto. La

sospensione viene colata dall’altro e il precipitato viene trattenuto dal filtro. Il filtro è un dischetto

sottile, il cui materiale viene scelto in base alla soluzione da filtrare. Se la soluzione è acquosa si

usano filtri di Acetato di Cellulosa, polimero derivato dalla cellulosa che presenta degli idrossili

acetilati, in modo da diminuire il potere adsorbente nei confronti delle proteine. La fibra che si

forma è stabilizzato da ponti idrogeno intermolecolari, com’era anche per la cellulosa non

modificata. Per soluzione organiche si usano filtri di PTFE (politetrafluoroetilene), polimero lineare

altamente fluorurato, la cui fibra è stabilizzata da interazioni di tipo idrofobico. Si usano anche filtri

di PVDF (polivinilidene difluoruro), commercialmente venduto come Durapore. Entrambe le

tipologie di filtri sono disponibili con diversa porosità, tra 0.1 μm e 1.2 μm, da scegliere in base alla

.

differente granulometria del sedimento che si vuole filtrare

28. Frazionamento degli organelli subcellulari mediante centrifugazione differenziale.

La centrifugazione differenziale è un metodo preparativo per la separazione delle diverse fasi dei

sistemi che sfrutta la diversa velocità di sedimentazione dei diversi componenti per dividerli in

sedimento e surnatante. La velocità di sedimentazione varia in base a numerose caratteristiche, in

particolare in base al rapporto m/r (massa su raggio idrodinamico) percui maggiore è questo

p

rapporto più veloce sarà la sedimentazione. Uno utilizzo di questa tecnica è il frazionamento degli

organelli subcellulari: si parte da un tessuto sminuzzato e omogeneizzato, si centrifuga l’estratto

grezzo a 600 g per 10 min ottenendo la sedimentazione dei nuclei che hanno coefficiente di

sedimentazione più elevato, poi raccolgo e centrifugo il surnatante a 3000g per 10 min facendo

sedimentare mitocondri, ribosomi e perossisomi che possiedono un coefficiente di sedimentazione

intermedio, centrifugando il nuovo surnatante a 16000 g per 10 min ottengo il deposito di lisosomi,

successivamente a 10000 g per 30 min separo i microsomi e nel surnatante finale ottengo proteine,

lipidi, sali ed eventuali acidi nucleici.

29. Tecniche di dialisi all’equilibrio

La dialisi è una tecnica che consente di separare una o più molecole ( nel nostro caso proteine)

disciolte in una soluzione sulla base delle loro dimensioni. La procedura prevede l’utilizzo di una

membrana semipermeabile che permette il passaggio selettivo di molecole. Il movimento delle

molecole si realizza a partire da una differenza di concentrazione (gradiente) di ciascuna di esse tra i

soluti presenti nei due compartimenti, quello all’interno del tubo e quello all’esterno. La diffusione

cessa una volta giunti all’equilibrio.

Ovviamente maggiore è il volume del tampone di dialisi (all’esterno) rispetto al volume della

soluzione che troviamo nel sacchetto da dialisi, maggiore sarà la diluzione delle proteine passando

dall’interno verso l’esterno e quindi maggiore sarà il numero di proteine che riusciamo ad estrarre

dall’estratto grezzo. Solitamente per evitare elevati volumi di tampone, si sostituisce il tampone da

un gradiente di concentrazione tra l’interno e

dialisi dopo qualche ora in modo tale da ristabilire

l’esterno.

Il processo di dialisi è un fenomeno di diffusione semplice e quindi abbastanza lento e dinamico, va

eseguito per tutta la notte in cella fredda o in un armadio refrigerato a 4°C in modo tale da

minimizzare le cinetiche enzimatiche e ridurre la proliferazione di muffe o batteri.

La dialisi è una procedura sfruttata per la desalificazione o per andare a separare proteine che

possiedono PM diversi tra loro andando così ad arricchire l’estratto grezzo.

30. Tecniche di ultracentrifugazione per la stima del peso molecolare di macromolecole

biologica. Equazione fondamentale.

Le tecniche di ultracentrifugazione hanno un impiego sia preparativo, in quanto consentono la

separazione del surnatante e del precipitato che si forma in seguito a precipitazione frazionata, sia

analitico: la centrifugazione infatti permette di stimare il peso molecolare di una proteina, DNA o di

contenuto nell’estratto da analizzare e purificare,

un complesso proteina-proteina oltre che operare

una separazione differenziale basata sui diversi pesi molecolari dei soluti. Il sistema di

centrifugazione consiste nella semplice rotazione di una particella attorno ad un asse di rotazione; le

forze in gioco in questo moto sono la forza centrifuga e la forza centripeta. La forza centrifuga è

Fc= m*[(ρp-ρs)/ρp]*ω²*r, con accelerazione centrifuga G= ω²*r, velocità angolare ω=

data da

2π*n/60 e r il raggio del rotore, m massa della particella, ρp densità della particella e ρs densità

della soluzione. Il rapporto (ρp-ρs)/ρp è un fattore di conversione (solitamente minore di 1),

direttamente proporzionale alla forza centrifuga stessa, che mi permette di calcolar