Tracciabilità molecolare degli alimenti

Concetti fondamentali nell'analisi analitica

La misurazione e l'analisi di campioni sono processi complessi che richiedono l'applicazione di concetti fondamentali. Alcuni di questi concetti includono:

• Accuratezza: grado di vicinanza tra il valore misurato e il valore vero.
• Precisione: grado di riproducibilità dei risultati di una misura.
• Intervallo utile: tratto (di solito lineare) dell'incremento (decremento) della variabile misurata in funzione della quantità (concentrazione) di analita.
• Ripetibilità: dispersione riscontrata in più determinazioni dello stesso campione.
• Riproducibilità: dispersione riscontrata in più determinazioni indipendenti di campioni simili, ma non identici, con metodiche simili, ma non identiche.
• Errore sistematico: errore non accidentale, ma che pesa nella stessa misura su ogni determinazione.

Una misura può essere accurata, ripetibile e precisa. I metodi inaccurati possono essere ripetibili e precisi, oppure non ripetibili e imprecisi. Gli errori casuali possono avvenire con la stessa probabilità sia in difetto che in eccesso e sono quelle incertezze sperimentali che possono essere rilevate mediante la ripetizione.

Tutte le tecniche di analisi molecolare non vengono viste come analisi analitiche, ma spesso si.

Le valutazioni sono quantitative e hanno valenza analitica; inoltre, le procedure che si mettono in atto hanno molte variabili da tenere in considerazione come anche la resa di estrazione dell'analita dalla matrice, l'efficienza della reazione, controlli positivi e negativi.

Polimerasi e PCR

Tutte le tecniche che si basano sull'uso delle DNA-polimerasi si basano sul pre-appaiamento di un frammento a doppio filamento che fornisce l'estremità OH libera su cui poi la polimerasi lega i nucleotidi trifosfato che dipende dal criterio del filamento stampo. Si ha l'esigenza di un'informazione per determinare la corretta successione delle basi; questo legame tra nucleotide trifosfato e innesco si ha con uno spostamento dell'estremità e quindi il primer viene a far parte dell'amplicone finale. La reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, PCR), è una tecnica che consente la moltiplicazione (amplificazione)

Che va nella direzione opposta a quella disintesi 3’5’ e serve per far sì che l’enzima possa rimediaread eventuali errori di incorporazione che possono essereintrodotti in modo casuale (nucleotide non corretto) edato che non si trova l’estremità giusta con questaattività si rimuove la base incorporata. Si cerca diamplificare regioni più piccole per avere meno erroripossibili. Inoltre, si ha anche un’attività 5’3’ nella stessadirezione di amplificazione, ovvero la polimerasi quando sintetizza il nuovo filamento e trova qualcosa di pre-appaiato lo idrolizza e lo rimuove fino alla completa degradazione e completa la sintesi di quanto stapolimerizzando a partire dal primer; questo è molto importante perché si basa la metodica di quantificazionePCR più diffusa, ovvero la tecnologia TAQ-man. Il concetto di proof reading ha importanza in ambitobiologico ma in vitro è irrilevante

perché si ha una discreta frequenza di mutazioni che vengono indotte con la PCR che commette degli errori; guardando l'amplicone non importa se si sbagliano poche basi, l'importante è ottenere la giusta lunghezza dell'amplicone. Determinare la temperatura di melting dell'amplicone formato si può fare anche se ci sono errori ma ha più importanza se si opera un'analisi della temperatura di melting ad alta risoluzione che permette di evidenziare anche mutazioni singole. Se la polimerasi trova davanti a sé un frammento pre-appaiato, allora l'attività esonucleasica 5'->3' porta alla degradazione del filamento che si trova davanti e in questo modo la polimerasi può formare il nuovo filamento senza formare molecole ibride. I nucleotidi degradati rimangono nel mezzo di reazione e dato che sono nucleotidi monofosfato non verranno utilizzati nei cicli successivi, è materiale che rimane.

liberonell'ambiente di reazione e non verrà mai utilizzato. La PCR avviene con reazione ciclica in tre step: denaturazione, appaiamento e prolungamento; oggi si utilizzano solo due cicli, quindi si mantiene il ciclo di denaturazione e poi l'appaiamento e il prolungamento avvengono in una fase sola perché avvengono alla stessa temperatura, si parla di two step PCR. Un altro fatto importante legato alla PCR è che da una molecola se ne originano 2, poi 4, 8, 16 ecc. questa regola è importante ma durante l'esecuzione di una PCR in termini quantitativi questa sequenza esponenziale deve essere verificata per vedere se effettivamente da una se ne formano due, 4 e così via perché quando viene mantenuta questa progressione si dice che l'efficienza globale della reazione è massima e pari al 100%. Una reazione ottimizzata ha un'efficienza del 100%; può succedere che non tutti i filamenti lavorino nello stesso modo e

quindi si ha un'efficienza più bassa con un accumulo di molecole inferiore (50-60%); questo può essere un problema se bisogna comparare reazioni diverse perché bisogna avere la certezza che tutte e due le reazioni portano allo stesso accumulo di amplicone. Si possono avere anche efficienze maggiori del 100% (anche 200%) quando la reazione porta alla produzione di ampliconi non specifici, quindi invece di ottenere l'amplicone con certa resa se ne ottengono di più; da una molecola di templato si ottengono più porzioni che non si riescono a discriminare e quindi globalmente l'efficienza è più alta. Questo è legato alla presenza di contaminanti che fanno perdere la specificità di appaiamento e di conseguenza si ha un più difficile confronto tra i campioni; si può accettare un'efficienza più bassa ma non più alta. La progressione si ha solo dal terzo ciclo in poi perchéprima non si ha la formazione di nessun tipo di amplicone. All'inizio della reazione si ha il filamento stampo, avvengono l'appaiamento dei primer e la polimerizzazione; nel secondo ciclo si separano i filamenti con l'originario e il filamento originato dopo il primo ciclo, avviene l'appaiamento primer sui filamenti parentali ma anche su quelli neosintetizzati e avviene la formazione di una molecola che non è amplicone ma comprende almeno uno dei due filamenti definito dalla posizione dei due primer. Iniziano ad apparire molecole ibride che comprendono un filamento dell'amplicone ma che non lo sono; dopo il secondo ciclo si fanno gli stessi passaggi e alla fine del terzo ciclo si inizia ad osservare la formazione delle prime due molecole di amplicone e da questo momento avviene il suo accumulo. Guardando e tracciando l'accumulo dell'amplicone in funzione del numero di cicli facendo il log si osserva un andamento dove a un certo punto la reazione.si fermae la quantità accumulata rimane costante. La fase esponenziale è limitata nel tempo perché si ha poi un plateau che è indipendente dalla quantità di template iniziale. I fattori che portano al plateau sono: la polimerasi è termostabile ma è un enzima che dopo un certo tempo riduce la sua attività perché inizia a denaturarsi e quindi la reazione perde di efficienza; si ha anche una progressiva riduzione di efficienza dello step di denaturazione perché quando si ha un grosso accumulo di amplicone avviene l'affollamento perché il numero di molecole presenti è molto alto e quindi questo fa sì che lo step di denaturazione di ogni ciclo diventi sempre meno efficiente. Si ha anche una riduzione dei reagenti come i primer perché questi vengono a far parte del prodotto e la quantità libera diminuisce nel tempo e quindi alla fine si ha un progressivo rallentamento.dell'amplificazione fino anche all'annullamento. Quando si mette a punto una reazione bisogna ottimizzare la quantità di pimer, DNA templato, nucleotidi trifosfato, magnesio, mettere a punto la temperatura di appaiamento (annealing), la durata degli step del ciclo e progettare i primer. Più lunghi sono gli step, più si ha la possibilità di avere appaiamenti aspecifici ma lo stesso anche per tempi troppo brevi in quanto quando si raggiunge la temperatura si ha una reazione parziale. Per quanto riguarda la progettazione dei primer, in genere la loro lunghezza è di 20-25 basi, devono essere unici per una regione del target e per far questo si usano programmi dedicati che aiutano nel determinare la sequenza e l'unicità di appaiamento; è importante fare attenzione anche all'appaiamento nella regione del primer in 3' perché la polimerizzazione parte dall'estremità 3' libero e se la polimerasi non

trova l'appaiamento ottimale degrada o non parte la sintesi del nuovo filamento. Bisogna essere certi che l'appaiamento sia particolarmente stabile; i primer non devono chiudersi su sé stessi per complementarietà. È importante la temperatura di appiamento degli oligonucleotidi che è sempre da verificare sperimentalmente ma ci sono regole per il punto di partenza: si usano formule che consentono la determinazione della temperatura di melting del primer su templato. Si può usare formula semplificata: Tm = 2 (A + T) + 4 (C + G) questa è una buona approssimazione per primer di 20-25 pb. Per quelli più complessi si usa un'altra formula più precisa: Tm = 69,3 + 0,41 (%CG) - 650/mer dove 650 è il PM medio di una coppia di basi. Non bisogna confondere la Tm con la temperatura di annealing che è quella a cui si fa avvenire l'appaiamento. Durante la PCR bisogna essere certi che tutti i siti possibili su templato

siano appaiati in modo che tutte i filamenti possano lavorare. La temperatura di annealing è di circa 5-10°C inferiore a Tm che viene comunque determinata sperimentalmente perché consente di avere un appaiamento sicuro di tutte le molecole; se si scende troppo di temperatura, il legame tra i filamenti potrebbe non essere stabile.