Totale Genetica

EVOLUZIONE DEL CONCETTO DI GENE

Ogni sequenza di aa in un peptide è codificata da una sequenza di nucleotidi di un gene.

Le proteine tra DNA e proteine sono state:

1 Gene = 1 Enzima (modificata poi in: 1 Gene = 1 Polipeptide)

 Colinearità una sequenza di nucleotidi corrisponde ad una sequenza

 

polipeptidica

I geni controllano le reazioni metaboliche attraverso la produzione di enzimi;

alterazioni nella sequenza genica si riflettono in alterazioni della sequenza proteica.

Dimostrazioni:

1902 Garrod dimostrò la relazione gene-fenotipo, attraverso l’analisi biochimica di



malattie metaboliche congenite nell’uomo, una delle quali era l’alcaptonuria, facilmente

diagnosticabile in quanto le urine degli individui affetti diventavano scure quando sono

esposte all’aria; la sostanza responsabile di questo cambiamento di colore è l’alcaptone

(o acido omogentisico), un prodotto intermedio della degradazione degli aa aromatici

tirosina e fenilalanina.

Egli riteneva che la presenza dell’alcaptone nelle urine fosse associata a un blocco

della normale via metabolica di questo composto e propose che l’alcaptonuria venisse

ereditata come un singolo gene recessivo. Sebbene i dettagli descritti della via

metabolica alterata dalla mutazione recessiva siano stati spiegati molti anni dopo,

Garrod comprese chiaramente le relazioni tra geni e metabolismo.

1909 Bateson pubblicò “Principi di ereditarietà di Mendel”.



1933 Beadle e Tatum dimostrarono la relazione tra gene ed enzima, attraverso



esperimenti su Neurospora crassa, poiché i ceppi wt erano prototrofi, in grado di

crescere in un terreno minimo, costituito da sali inorganici, una fonte di C, una fonte

di N e biotina; individuarono anche mutanti auxotrofi (mutanti tradizionali), che non

erano in grado di vivere un terreno minimo. -

Vennero isolati diversi mutanti auxotrofi per l’arginina, arg :

Mutanti arg-I crescono se vengono aggiunti al terreno minimo arginina,

 

citrullina o ornitina

Mutanti arg-II crescono se vengono aggiunti al terreno minimo arginina,

 

citrullina

Mutanti arg-III crescono se viene aggiunto al terreno minimo solo arginina

 

Conclusioni: arg-I, arg-II e arg-III codificano per 3 enzimi, che intervengono in

successione nella conversione di un precursore in ornitina, citrullina ed infine in

arginina. arg-I arg-II arg-III

enzima A enzima B enzima C

PRECURSORE ORNITINA CITRULLINA ARGININA

  

Se manca l’enzima A, si può ovviare al problema aggiungendo al terreno uno dei

qualsiasi intermedi; nei mutanti di classe II, non si ha produzione dell’enzima B e

quindi non è necessario aggiungere ornitina, poiché non può essere convertita in

citrullina. Infine, nei mutanti di classe III, non è necessario inserire ornitina e

citrullina poiché manca l’enzima C, che converte la citrullina in arginina.

TEST DI COMPLEMENTAZIONE (o Test in Trans)

Consente di stabilire se le mutazioni, che producono uno stesso fenotipo o fenotipi

simili, siano localizzate nello stesso gene o in geni differenti; le coppie di mutazioni

vengono analizzate determinando il fenotipo degli eterozigoti in trans: si devono

costruire eterozigoti in trans per ciascuna coppia di mutazioni da analizzare, per poi

determinare se questi abbiano fenotipo selvatico o mutante. Le mutazioni devono

essere recessive.

Il test in trans dovrebbe essere fatto insieme al test in cis (spesso omesso),

attraverso la costruzione di eterozigoti in cis. L’insieme dei due test viene detto test

cis-trans.

Risultati possibili:

Eterozigote in trans con fenotipo

 MUTANTE le mutazioni sono



localizzate nello stesso gene, quindi

entrambi i cromosomi conterranno

una copia difettiva di quel gene

Eterozigote in trans con fenotipo

 SELVATICO le mutazioni si trovano



in due geni differenti

Le informazioni fornite dal test di complementazione sono totalmente diverse da

quelle ottenute dalle analisi di ricombinazione: i risultati del test di complementazione

indicano se le mutazioni sono alleliche, mentre quelli delle analisi di ricombinazione

indicano se sono associate e, se è così, consentono di stabilire quanto sono distanti sul

cromosoma.

Cistrone = definita come l’unità funzionale, o gene, del test di complementazione.

Complementazione Intragenica di solito i test di complementazione non sono



ambigui quando vengono analizzate mutazioni che determinano la mancata sintesi di un

prodotto genico, la sua sintesi parziale o la sintesi di un prodotto non funzionale.

Quando vengono analizzate mutazioni che determinano sostituzioni di aa, il test in

trans può essere ambiguo, a causa della complementazione intragenica.

Le forme funzionali di alcune proteine sono dimeri o multimeri, con polipeptidi

prodotti da un singolo gene (omologhi) o da geni diversi (non omologhi); la

complementazione intragenica può avvenire quando la forma attiva della proteina è

costituita da due o più polipeptidi omologhi.

omodimero

Esempio di : in organismi omozigote per l’allele selvatico di un gene, tutti i

dimeri proteici saranno costituiti da polipeptidi selvatici identici; organismi omozigoti

per una mutazione dello stesso gene produrranno dimeri costituiti da polipeptidi

mutanti. Un organismo eterozigote per due differenti mutazioni del gene produrrà

alcuni dimeri costituiti da due polipeptidi mutanti differenti, definiti etero dimeri;

questi possono avere funzionalità parziale o wt e, in questo caso, è avvenuta

complementazione intragenica e l’eterozigote in trans può avere fenotipo selvatico o

intermedio.

BATTERIOFAGI

I geni presenti sui cromosomi dei batteriofagi possono essere ordinati secondo una

mappa usando le frequenze di ricombinazione e le distanze di mappa vengono calcolate

in cM, come numero medio di crossing over che si verificano tra i marcatori genetici.

I fagi presentano molti tipi differenti di mutazione.

Alcuni dei primi fagi mutanti, che furono studiati, presentavano una morfologia di

placca alterata; tra questi da ricordare i mutanti di T4 a lisi rapida (r). Essi producono

placche ampie con margini netti; quando un T4 si attacca ad una cellula di E. coli, già

infettata da un T4 wt, innesca la sintesi di nuovo materiale della parete cellulare e può

ritardare la lisi INIBIZIONE della LISI.



Un’altra mutazione alterava l’abilità del fago di infettare ceppi ospiti, come il ceppo di

E. coli B che può essere infettato da T-pari wt (T2, T4 e T6); il ceppo di E. coli B2

porta una mutazione che lo rende resistente all’infezione di T2, poiché altera il

recettore del T2 sulla superficie batterica. Un ceppo mutante del T2, il T2h, però,

porta una mutazione (h) che gli permette di infettare sia il ceppo wt che quello B2.

Nel 1946, Hershey e Delbrück scoprirono la ricombinazione genetica nei fagi; poco

dopo, Hershey e Rotman condussero i primi esperimenti, incrociando mutanti h e r:

+ +

Infezione simultanea del batterio E. coli B con due ceppi di T2, cioè h r e hr

 Replicazione dei cromosomi fagici nella cellula batterica (ciclo litico)

 Durante la replicazione si verifica ricombinazione tra i due tipi di cromosomi

 + +

Il batterio è lisato e rilascia sia individui della progenie parentale, h r e hr ,

 + +

che individui della progenie ricombinante, h r e hr; i genotipi della progenie

sono stati determinati piastrandola su un misto di cellule di E. coli B e B2

Locus rII del Batteriofago T4

I mutanti rII di T4 sono letali condizionali; possono crescere su alcuni ceppi di E. coli,

come il B, ma sono letali per altri, come il K12(λ).

Tra il 1953 e il 1962, Benzer fece una mappatura per struttura fine di questo gene;

studiò la letalità condizionata dei mutanti rII, mappando 2400 mutanti di rII in 308

siti separabili per ricombinazione in due geni contigui.

Fenotipo del mutante rII:

Differenza nella morfologia di placca produce grandi placche di lisi sulle

 

cellule batteriche di E. coli B

Differenze nello spettro d’ospite (vedi sopra)



Benzer si chiese quanti geni fossero definiti da tutti i mutanti scoperti di rII;

condusse così un test di complementazione: infettò contemporaneamente cellule di E.

coli K12(λ) con due mutanti differenti rII e andò ad osservare se le cellule infettate,

ovvero gli eterozigoti in trans, avessero fenotipo mutante o wt. Tutti i test

confermarono che tutti i mutanti contenevano mutazioni in uno dei due geni, indicati

con rIIA e rIIB; in pochi casi le mutazioni interessavano entrambi i geni.

Dopo aver identificato le mutazioni, le utilizzò come riferimento: infetto cellule di

E.coli K12(λ) con ciascun nuovo mutante rII e in un caso con un mutante rIIA e

nell’altro con un mutante rIIB: se i due mutanti avessero avuto mutazioni nello stesso

gene (entrambi o rIIA o rIIB), non sarebbero cresciuti in E. coli K12(λ); se avessero

avuto mutazioni in geni differenti sarebbero cresciuti, esprimendo fenotipo wt.

Per mappare il locus rII, Benzer inizialmente utilizzò l’approccio della mappatura

attraverso l’incrocio a due fattori: gli incroci erano condotti infettando

contemporaneamente cellule di E. coli B con due mutanti rII e analizzando la progenie

+

per la presenza di ricombinanti wt (r ); se fosse avvenuta ricombinazione tra le due

mutazioni si sarebbe dovuto originare un cromosoma selvatico e uno doppiamente

mutato. Evento raro, poiché la distanza tra i due geni è piccola.

Se la progenie ottenuta viene piastrata su E. coli K12(λ), gli unici fagi in grado di

crescere erano quelli ricombinanti wt.

Si possono calcolare: 9

Tecnica con risoluzione molto alta: poteva determinare la ricombinazione ogni 10 fagi.

Con questa tecnica mappò circa 60 mutazioni indipendenti di rII; tuttavia era una

metodica molto faticosa e avrebbe impiegato anni per mappare le 2400 mutazioni.

Sviluppò quindi un nuovo metodo, molto efficiente, detto mappatura per delezione: ha

mappato mutanti con 7 mutazioni per grosse delezioni nella regione rII, ricombinandoli

con 47 mutanti per delezioni minori o puntiformi.

I mutanti con delezione non possono ricombinare con mutanti puntiformi che mappano

nella regione deleta:

Dato che non può avvenire ricombinazione nell’area deleta, non possono essere

prodotti ricombinanti wt del gene interessato da delezione; questi incroci, tra mutanti

puntiformi e per delezioni, sono un tentativo di individuare la posizione delle mutazioni

e la possibilità di formare fagi ricombinanti wt in grado di crescere si K12(λ). Una

volta determinati questi ricombinanti wt, incrociò fagi con mutazioni puntiformi nella

ste