Tossicologia

IMMUNOTOSSICOLOGIA

Come immunotossina viene definita una qualsiasi sostanza in grado di alterare una o più funzioni del sistema

immunitario. Queste sostanze possono andare ad agire su una qualsiasi delle componenti del sistema

immunitario, sia della componente dell’immunità innata (risposta rapida) che di quella adattativa (risposta

lenta), e il risultato della loro azione è la comparsa di un effetto avverso.

Sono stati effettuati diversi studi che hanno permesso di evidenziare come per alcune sue caratteristiche, il

sistema immunitario sia particolarmente sensibile agli xenobiotici. Queste sue caratteristiche sono tre:

- Il sistema immunitario non è una struttura già ben definita fin dalla nascita, ma quando si nasce è ancora in

via di sviluppo, infatti i neonati e i bambini piccoli sono più soggetti a patologie in questo campo;

- Le componenti del sistema immunitario sono in continuo rinnovo e questo le rende più suscettibili

all’attività dello xenobiotico;

- Durante lo svolgimento delle sue attività, il sistema immunitario è finemente regolato, così come la risposta

che dà all’aggressione di un patogeno.

Il sistema immunitario ha il compito principale di difendere l’organismo da agenti estranei permettendo di

mantenere l’integrità di organi e tessuti, grazie al fatto che è in grado di distinguere il self dal non self: è in

grado di distinguere ciò che è proprio dell’organismo e che quindi deve essere conservato da ciò che è

estraneo. È un sistema altamente regolato che permette il riconoscimento dell’agente estraneo e

l’attivazione delle specifiche componenti per l’eliminazione che vanno incontro ad un processo di

maturazione, replicazione e differenziazione per acquisire le caratteristiche fondamentali per determinare la

risposta più appropriata; dopo l’attacco ci si trova di fronte a un sistema immunitario attivato, quindi si ha

una seconda fase del ritorno alla situazione di omeostasi in cui le cellule attive vengono eliminate con ritorno

a una situazione basale. Senza l’omeostasi, il processo infiammatorio che generalmente accompagna le

risposte andrebbe avanti e porterebbe a un coinvolgimento dei vari tessuti e organi comportando un

danneggiamento dell’organismo.

Il sistema immunitario è costituito da elementi che vanno incontro a un continuo processo di rinnovamento:

si ha la produzione degli elementi primari a livello del midollo osseo, e successivamente questi migrano per

andare in organi linfoidi o immunocompetenti dove avverrà la loro maturazione. Questo vale per i linfociti T

e B ma anche per le altre cellule come eosinofili che migrano verso le cellule dell’intestino dove raggiungono

una completa maturazione. Il sistema immunitario quindi è costituito da cellule di diversa natura che

agiscono simultaneamente e in modo coordinato per portare all’eliminazione dell’agente estraneo.

Il sistema immunitario è suddiviso in due categorie:

- Immunità innata: presenta barriere fisiche e biochimiche e quindi tutti gli epiteli di rivestimento, la presenza

di un pH acido a livello delle mucose, la presenza di secreti a livello delle mucose che hanno azione di difesa

come il lisozima, e le proteine del complemento. Vi sono poi cellule polimorfonucleate responsabili della

prima fase della risposta immunitaria che è quella meno specifica ma più rapida e permette alla

componente acquista di svilupparsi. La prima fase comprende cellule come i granulociti (eosinofili, basofili

e neutrofili) e monociti, macrofagi e cellule Natural Killer.

- Immunità acquisita: presenta linfociti B e T , e ha la caratteristica di essere specifica verso un agente

patogeno che viene appunto riconosciuto in modo specifico dai linfociti attraverso il riconoscimento di un

antigene che può essere una proteina, un polisaccaride o un lipide. Se il patogeno è cellulare si ha

un’immunità cellulo-mediata portata avanti dai linfociti T, se invece il patogeno è extracellulare si ha

un’immunità umorale portata avanti dai linfociti B e T mediante la produzione di anticorpi.

Effetti degli xenobiotici

Gli xenobiotici possono indurre sul sistema immunitario immunosoppressione, immunostimolazione,

autoimmunità o ipersensibilità. La suscettibilità all’effetto di un immunotossico dipende da tre fattori, e

questi non influenzano il tipo di risposta ma la dose a cui questa si manifesta. I fattori in particolare sono:

- Condizioni di esposizione: dose, frequenza di esposizione allo xenobiotico, durata di esposizione e via di

esposizione (alcune vie determinano alcuni effetti specifici);

- Fattori legati al soggetto: corredo genetico, età (i bambini e gli anziani sono più suscettibili alla comparsa di

effetti, i primi perché hanno un sistema immunitario non ancora ben sviluppato, e i secondi perché hanno

un sistema immunitario in via di senescenza), stato di salute, stile di vita e utilizzo di altri farmaci;

- Fattori legati alla sostanza: reattività chimica e sua biotrasformazione (ad esempio gli allergici alla Penicillina

non hanno un effetto avverso legato a questa ma a un suo prodotto di trasformazione).

Immunosoppressione

L’immunosoppressione può riguardare una qualsiasi delle componenti del sistema immunitario con riduzione

della sua funzionalità che si traduce in una maggiore incidenza di malattie infettive o in una maggiore

comparsa di tumori. L’immunosoppressione può essere:

- Primaria: è determinata geneticamente ed è causata da alterazioni di geni coinvolti nel controllo della

risposta immunitaria. Ad oggi sono state identificate almeno 150 forme di immunosoppressione primaria.

- Secondaria: deriva da modificazioni reversibili o irreversibili del sistema immunitario causato da fattori

esterni come alcune patologie (cancro), infezioni virali (HIV, morbillo e varicella), casi di malnutrizione,

invecchiamento o esposizione a xenobiotici tra cui anche i farmaci.

Alcuni dei farmaci che hanno dimostrato di avere un effetto immunosoppressivi sono ad oggi utilizzati con

questo scopo, ad esempio nel caso di trapianti, lupus e artrite reumatoide. Altri farmaci utilizzati nella terapia

oncologica invece possono portare come effetto avverso a una riduzione del quantitativo di cellule del

sistema immunitario con diminuzione della sua attività.

Immunostimolazione

Tutte le volte che il sistema immunitario incontra un antigene si ha un’immunostimolazione specifica che

porta all’attivazione di quelle componenti volte all’eliminazione dell’agente patogeno. Quando invece si parla

di immunostimolazione dovuta a uno xenobiotico si ha un’immunostimolazione generalizzata con

stimolazione di tutte le componenti del sistema immunitario.

L’immunostimolazione si ha con terapie a base di citochine ricombinanti soprattutto con interferoni utilizzati

nella terapia oncologica, nella terapia virale per l’epatite cronica B e C, nell’Herpes simplex virus, nella sclerosi

multipla o nella malattia granulomatosa cronica. L’immunostimolazione si ha anche con le vaccinazioni, e in

entrambi i casi si ha la comparsa di sindromi semi-influenzali con febbre, dolori muscolari, astenia, ecc.

Data dall’immunostimolazione vi è la sindrome da rilascio di citochine, e l’effetto è associato all’utilizzo di

anticorpi monoclonali come il Rituximab utilizzato nella terapia tumorale soprattutto nei linfomi. Il forte

rilascio di citochine porta ad una attivazione incontrollata di cellule B, cellule T, macrofagi e cellule NK e

quindi comporta un aumento della temperatura corporea, ipotensione e comparsa di cardio e neurotossicità.

Autoimmunità

In alcuni casi gli xenobiotici possono portare alla comparsa di autoimmunità, patologia in cui si ha la risposta

del sistema immunitario verso un antigene self, quindi si ha la produzione di anticorpi e distruzione del

tessuto che presenta quell’antigene. La reattività di alcuni xenobiotici può quindi portare alla formazione di

antigeni mediante la modificazione di strutture cellulari, antigeni che poi vanno ad attivare il sistema

immunitario. Gli xenobiotici possono ad esempio modificare delle proteine, carboidrati o glicolipidi creando

antigeni che quindi non risultano più essere dell’organismo in quante modificati, ma essendo legate a cellule

dell’organismo portano alla distruzione dell’organo in cui sono presenti.

Le manifestazioni possono essere diverse perché dipendono dall’organo in cui è avvenuta la modificazione.

Vi è un’elevata associazione tra la comparsa della manifestazione e l’utilizzo di alcuni xenobiotici tra cui anche

i farmaci, e in particolare le patologie che compaiono più frequentemente sono l’anemia emolitica

autoimmune e il Lupus.

Nell’anemia emolitica autoimmune vengono generati degli anticorpi che riconoscono come antigene delle

componenti espresse sul globulo rosso, quindi si ha la distruzione degli eritrociti da parte del sistema

immunitario, e come conseguenze si hanno riduzione dell’apporto di ossigeno, incapacità dei tessuti di

compiere la respirazione, ecc. Ad oggi sono stati identificati circa un centinaio di farmaci che possono indurre

l’anemia emolitica autoimmune tra cui le cefalosporine, levodopa e metildopa, penicilline e alcuni FANS. Per

verificare che l’anemia emolitica autoimmune sia associata all’assunzione di un farmaco è necessario

interrompere la somministrazione e verificare se vi è una regressione della malattia.

Altra patologia immune particolarmente associata all’utilizzo di farmaci è il Lupus eritematoso sistemico. Il

Lupus può interessare qualsiasi organo o apparato e quindi può determinare sintomi e quadri clinici differenti

da paziente a paziente. La patologia è caratterizzata da fasi in cui si ha l’acutizzazione della patologia e quindi

il soggetto sta male, e da fasi di remissione in cui il soggetto vive uno stato di relativo benessere. Le

caratteristiche del Lupus indotto da farmaci sono molto simili, e la grossa differenza è che si ha una completa

regressione della patologia nel momento in cui il soggetto sospende il farmaco incriminato. Ad oggi più di 90

farmaci sono associati alla comparsa di Lupus, in particolare Procainamide e Idralazina sono associate ad un

elevato rischio di induzione della patologia.

Ipersensibilità

Le reazioni di ipersensibilità sono risposte antigene-specifiche ma sono inappropriate. Affinché si verifichino

sono necessarie due esposizioni: la prima esposizione consiste nella sensibilizzazione all’antigene, la seconda

esposizione invece consiste nella comparsa del fenomeno di ipersensibilità. Le reazioni di ipersensibilità

possono essere divise in base alla cinetica in immediate (compaiono in pochi minuti o ore) o ritardate

(compaiono in un giorno) e in base ai meccanismi immunologici coinvolti possono essere divise in quattro

tipi.

L’ipersensibilità di tipo I è di tipo anafilattico, ed è una risposta ad antigeni che induce una risposta umorale.

Sono coinvolte principalmente le cellule Th-2 che mediante la produzione di IL-4 e IL-13 portano le cellule B

a esprimere anticorpi antigene-specifici di classe IgE, che sono le principali immunoglobuline coinvolte nelle

risposte allergiche. Le IgE si legano ai recettori ad alta affinità presenti a livello dei mastociti rendendoli

sensibilizzati alla presenza dell’antigene. Un secondo incontro con l’antigene viene riconosciuto subito dalle

IgE che porteranno al rilascio di tutti i mediatori presenti nei mastociti (istamina, leucotrieni, citochine).

A seconda della sede e dell’escrezione della risposta si può avere shock anafilattico (a livello sistemico) o

asma e dermatite atopica (a livello tissutale), e sono tutte reazioni rapide che si verificano dopo 15 minuti

dall’esposizione. L’ipersensibilità di tipo I si può osservare ad esempio in seguito all’esposizione di penicillina,

cefalosporine o metalli pesanti.

L’ipersensibilità di tipo II è di tipo citolitico, ed è mediata da anticorpi IgM e IgG. Gli anticorpi si legano agli

antigeni che normalmente sono presenti sulle cellule e inducono l’attivazione del complemento e delle

cellule fagocitiche. Cefalosporine, Penicilline, Tetracicline e la Metil-dopa sono in grado di indurre

l’ipersensibilità di tipo II.

L’ipersensibilità di tipo III è mediata da anticorpi IgG. Gli anticorpi si legano ad antigeni solubili formando

immunocomplessi, i quali possono depositarsi sui vasi andando ad innescare una risposta infiammatoria e

richiamando quindi cellule del sistema immunitario. L’intensità della reazione dipende dal quantitativo di

antigeni e dalla loro distribuzione: se gli antigeni sono ad esempio localizzati a livello del sito di ingresso si ha

una risposta localizzata, se invece sono entrati all’interno dell’organismo si ha una risposta sistemica.

L’ipersensibilità di tipo III può essere dovuta alle Penicilline.

L’ipersensibilità di tipo IV (o ritardata) vede l’attivazione dei linfociti Th-1. Si ha la produzione di citochine che

va a richiamare leucociti (tra cui i macrofagi) e nel giro di 24-48 ore si genera una risposta infiammatoria nella

sede in cui si è presentato l’antigene. Un esempio di ipersensibilità di tipo IV sono le dermatiti da contatto

che sono dovute all’esposizione a metalli pesanti ma anche alla Penicillina e Aureomicina.

La Penicillina ha rappresentato un importante modello per studiare le reazioni di ipersensibilità dei farmaci.

Grazie a questi studi si è scoperto che non solo il farmaco di per sé ma anche i prodotti di trasformazione

possono essere determinanti antigenici e quindi dare origine alle risposte di ipersensibilità. In particolare

l’acido penicilloico sembra essere il principale responsabile di queste reazioni: va a legarsi a livello di diverse

proteine, quindi risulta particolarmente reattivo e può dare origine alla comparsa di antigeni, e a seconda

della distribuzione e del quantitativo di antigene prodotto si possono avere shock anafilattico o orticaria,

anemia emolitica, malattia da siero (viene contratta spesso da chi fa trasfusioni e vede la comparsa di febbre,

dolori muscolari, ecc) e dermatite da contatto. È stato osservato come spesso le persone che hanno

dimostrato ipersensibilità da tutte le penicilline sviluppano ipersensibilità anche verso le cefalosporine, e

questo ha dimostrato anche la possibilità di reazioni crociate.

Valutazione dell’immunotossicità

Vista la complessità del sistema immunitario, è evidente che sono necessari diversi saggi per poter valutare

il danno indotto da uno xenobiotico o da un farmaco, e in genere si utilizza un protocollo a gradini: si parte

da saggi che danno una valutazione più generica, per andare a saggi più specifici che verificano se

effettivamente vi è un effetto, quale componente del sistema immunitario è coinvolto nell’effetto, e qual è

il meccanismo che determina la comparsa dell’effetto.

Se prima le valutazioni dell’immunotossicità non erano prese molto in considerazione, negli ultimi anni invece

è stata effettivamente confermata la necessità di questi studi relativi ai farmaci nella sperimentazione pre-

clinica. Nel 2002 l’EMA ha emanato un documento sugli studi di tossicità cronica in cui viene riportata una

esplicita indicazione per l’esecuzione dei saggi immunotossicologici pre-clinici. Nel 2002 l’FDA ha redatto

anch’essa un documento, ed entrambi i documenti concordano sulla necessità di effettuare questi studi, ma

non erano conformi nelle modalità e in alcuni tipi di valutazioni. Nel 2004 è stata effettuata

un’armonizzazione dei processi di valutazione, e sono state stabilite delle linee guida che vengono seguite

per effettuare i saggi di immunotossicità, soprattutto per i farmaci ad uso umano.

I protocolli a gradini prevedono inizialmente una valutazione basale per individuare gli effetti generici sul

sistema immunitario, poi l’individuazione degli effetti e i meccanismi alla loro base. Ad oggi questi studi

prevedono solamente la valutazione dell’immunosoppressione e l’immunostimolazione. Il protocollo

standard prevede la somministrazione giornaliera del farmaco per 28 giorni su roditori (topi o ratti), e

vengono testate più dosi perché deve essere definita una dose dipendente dell’effetto e per definire la dose

a cui non si osserva immunotossicità. Al termine dei 28 giorni viene effettuata una conta totale e differenziale

dei leucociti, viene sacrificato l’animale e viene misurato il peso di timo milza e linfonodi, viene effettuato un

esame istologico per gli organi coinvolti nello sviluppo del sistema immunitario (timo, midollo osseo ottenuto

dal femore, milza e linfonodi), vengono infine valutati i livelli di Ig circolanti e l’incidenza di infezioni e tumori.

Tutti i risultati verranno poi valutati insieme al meccanismo d’azione del farmaco e il suo uso terapeutico, per

stabilire se effettivamente l’effetto immunotossico è importante per quel tipo di farmaco e per stabilire

l’eventuale necessità di studi più specifici. Mediante questi studi è già possibile avere un’indicazione del fatto

che l’effetto immunotossico è immunosoppressorio o immunostimolatorio: se si nota una diminuzione degli

organi linfoidi molto probabilmente vi è un’immunosoppressione, se invece si nota un aumento vi è

immunostimolazione. Successivamente viene effettuata un’analisi dei fenotipi delle cellule del sistema

immunitario per valutare se la diminuzione o l’aumento sono a carico di tutte o solo alcune popolazioni: viene

effettuata quindi un’analisi istochimica per milza e timo, mentre vien effettuata un’analisi a marcatura per il

midollo osseo. Le marcature permettono di identificare le popolazioni coinvolte, ma non solo: visto che

du