Lezioni, Tossicologia

Tossicologia generale

La tossicologia si occupa dello studio qualitativo e quantitativo degli effetti tossici prodotti dagli xenobiotici sugli organismi viventi. I due scopi fondamentali della disciplina sono:

• Descrivere l'effetto tossico e il meccanismo d'azione (stima qualitativa della pericolosità);
• Valutare la probabilità d'insorgenza di danni alla salute a determinate esposizioni (stima quantitativa del rischio).

Si tratta di un processo autoreferenziale: inizialmente studiava cosa succedeva all’uomo, ora il campo è stato ampliato. La tossicologia segue fondamentalmente tre passaggi: studiare e vedere l’effetto, capire il perché, stimare il danno.

Il tossicologo esamina la natura degli effetti tossici prodotti dagli xenobiotici sugli organismi viventi e valuta la probabilità della loro comparsa (valutazione del rischio); è in grado di prevenire, diagnosticare e curare eventuali intossicazioni date da sostanze specifiche. La tossicologia può essere applicata a tutto ciò con cui siamo a contatto: farmaci, pesticidi, additivi alimentari, etc.

Tossicologia ambientale ed ecotossicologia

Tossicologia ambientale ed ecotossicologia non si basano sull’uomo: la prima ha ancora riferimenti verso l’uomo, ma è posta anche ad altre specie; la seconda, invece, è molto più complessa perché non è più riferita a qualcosa di specifico, ma ad un ecosistema e su cosa succede quando quest’ultimo subisce un cambiamento.

La base della tossicologia è stata coniata da Paracelso: tutte le sostanze sono veleni, la differenza tra la tossicità e l’avvelenamento è basata sostanzialmente sulla dose.

Definizioni chiave

Xenobiotico: Sostanza estranea alla normale nutrizione dell’organismo e al suo normale metabolismo; è una sostanza esogena che viene introdotta nell’organismo (es. farmaco). Gli xenobiotici sono generalmente sostanze inorganiche che non stimolano i sistemi immunitari; alcune volte, però, è possibile che queste sostanze si leghino a proteine, le quali cambiano conformazione e permettano che quest’ultima venga riconosciuta come estranea. Affinché questo processo di estraneazione avvenga, è necessario che prima avvenga un processo di sensibilizzazione.

Veleno: non è un termine definibile; per alcuni è una sostanza che in quantità molto piccole è in grado di avere proprietà tossiche, oppure che in elevate quantità non produce nessun effetto benevolo.

Sostanza tossica: Sostanza in grado di recare effetti dannosi solo in determinate condizioni, quali dose, età, sesso e specie.

Effetto tossico: Effetto principale visibile usando una determinata sostanza; si può notare il meccanismo con il quale la sostanza ha procurato il danno.

Effetto collaterale: Effetto non desiderato di uno xenobiotico, ma noto e prevedibile, solitamente associato al suo meccanismo d’azione.

Effetto avverso: Effetto desiderato ed imprevedibile di uno xenobiotico, solitamente non associato al suo meccanismo d’azione.

Effetti tossici dei farmaci

Tutti i farmaci presentano un effetto collaterale, e quindi un effetto tossico, poiché presentano un effetto intrinseco associato al suo meccanismo d’azione. Sia l’effetto collaterale che quello tossico sono dose-dipendenti; purtroppo esistono anche effetti tossici che non sono dose-dipendenti, come l’effetto avverso, e sono effetti imprevedibili perché causati dalle difese del sistema immunitario.

Spettro degli effetti tossici

Lo spettro degli effetti tossici può presentare diversi casi:

• Reazione allergica
• Reazione idiosincratica, si manifesta solo in pochi soggetti ma non nella maggior parte dei casi (es. succinilcolina che viene degradata dalle esterasi nel sangue)
• Tossicità immediata
• Tossicità ritardata
• Tossicità reversibile, il danno è riparato dall’organismo perché questo è altamente proliferativo (es. fegato)
• Tossicità irreversibile, il danno non può essere riparato dall’organismo, perché questo non è altamente proliferativo (es. sistema nervoso centrale). Questa può essere distinta a sua volta in due tipi di studi:
  • Effetti carcinogeni
  • Effetti teratogeni
• Tossicità locale, se viene danneggiata solamente una parte dell’organismo
• Tossicità sistemica, può colpire l’interno di un organismo o arrivare ad un determinato target.

Tossicità immediata e ritardata sono sinonimi di tossicità acuta e cronica: queste due vengono distinte a seconda del tempo di esposizione alla sostanza tossica, e spesso non coincidono.

Relazione dose-effetto

Si tratta di una relazione che descrive l'intensità dell'effetto biologico in funzione della quantità a cui sono esposti i modelli sperimentali o l'uomo, e senza questa è impossibile determinare la tossicità di una sostanza. Affinché sia possibile questa relazione, è necessario che vengano soddisfatte determinate caratteristiche:

• L’effetto osservato deve essere dovuto all’agente tossico;
• La risposta osservata deve essere funzionale alla dose;
• Deve essere utilizzato un metodo di quantificazione molto preciso per misurare gli effetti.

Senza questi tre elementi non è possibile dimostrare la tossicità di uno xenobiotico; questa relazione è fondamentale. La funzione che lega effetto e dose è una sigmoide. Da questa si può ricavare la relazione dose-effetto, dove quest’ultimo è definito a seconda dell’esperimento in corso. La funzione è una sigmoide poiché ad un basso dosaggio le sostanze non sono tossiche, fino a quando non arrivano ad un plateaux dove raggiungono il massimo del loro effetto. Il fattore di sicurezza è un range in cui il dosaggio non ha alcun effetto, e quindi non può essere considerato tossico. NOEL è l’ultimo punto a cui non osservo un effetto della sostanza, ed è seguito dal LOEL, primo punto dove si nota l’effetto della sostanza; questi due punti sono relativi al modello sperimentale utilizzato.

Nell’osservazione della curva risulta fondamentale la sua inclinazione; per renderla più rettilinea possibile, nella valutazione dell’effetto si passa da una scala aritmetica ad una logaritmica, nelle quali il minimo e il massimo sono unite da una retta che permette di confrontare diverse sigmoidi e trovare la funzione della retta. Per rettilineizzare la relazione, è anche possibile utilizzare anche probabilità legate ad una regressione di tipo binario. Questo processo permette di:

• Determinare e paragonare più sostanze nello stesso grafico; determinare la diversità degli xenobiotici e il dosaggio permette di comprendere l’effetto massimo e da quale delle due sostanze è in grado di raggiungerlo: questo fenomeno è chiamato potenza. [Figura 2, a sinistra]
• Mostrare una diversità di efficacia quando uno dei due xenobiotici non raggiunge un massimo effetto [Figura 2, a destra].

DL o LD: dose letale

DL o LD: sigla che indica la dose letale di una sostanza. Indica a quale livello ha ucciso il 50% degli individui in studio, determinando la pericolosità della sostanza che si sta trattando; questo indice però non è completo, perché non indica che LD uguali abbiano curve con la stessa pendenza. È possibile che il valore di LD sia uguale, ma una delle due sostanze abbia un maggior rischio con un dosaggio minore, in questo caso B.

Effetti delle curve sigmoidi

È possibile trovare altri tipi di curve, per esempio sigmoidi rovesciate che si toccano: questo tipo di curva è visibile quando si studia la tossicità di una sostanza necessaria all’organismo. Queste sostanze hanno un effetto dannoso in due casi:

• Carenza, quando la dose è minima;
• Eccesso, quando la dose è troppo elevata.

Le sostanze in grado di produrre questi effetti sono delle sostanze non xenobiotiche.

Tossicocinetica e tossicodinamica

Le sostanze tossiche per esercitare il loro effetto si compongono di:

• Tossicocinetica, che studia la capacità del nostro organismo di entrare in contatto con una sostanza, ed è un modello sperimentale;
• Tossicodinamica, che studia il meccanismo d’azione della sostanza sull’organismo.

Tossicocinetica

Si tratta di una tossicologia che ha come riferimento un modello biologico, e studia l’effetto di uno xenobiotico su un organismo: si tratta di ciò che il modello sperimentale è in grado di fare sulla sostanza in studio. La tossicocinetica comporta principalmente quattro fasi, determinate dall’acronimo ADME:

1. Assorbimento della sostanza
2. Distribuzione della sostanza
3. Metabolismo della sostanza o biotrasformazione
4. Eliminazione della sostanza

L’assorbimento è il periodo tra l’esposizione alla sostanza, fino al suo passaggio in un compartimento fondamentale, che permetterà a questa di viaggiare all’interno del modello in studio. L’esposizione può avvenire in diversi modi:

• Per contatto, tramite diverse vie, tra cui la via inalatoria, la via enterale, la via topica;
• Per vie più complesse, nelle quali si entra in campo farmacologico. Per queste vie è necessario uno strumento o una macchina per permettere che la sostanza venga assorbita, definendo così la via parietale.

Per comprendere se una sostanza è tossica, è fondamentale conoscere la via di somministrazione: è la prima caratteristica importante, seguita dalla distribuzione, dal metabolismo e dalla sua eliminazione. Quando una sostanza entra direttamente nella circolazione sanguigna non si parla più di assorbimento, questo perché questa fase deve superare alcune problematiche, come il superamento delle barriere cellulari. Infatti, generalmente, per raggiungere il compartimento di interesse, la sostanza deve superare componenti idrofobe ed idrofobiche, richiedendo così una facile reversibilità per permettere di attraversare entrambe le membrane. Affinché la molecola passi attraverso le membrane perdendo il profilo di idrofobicità, è necessario che le dimensioni siano ridotte. Le sostanze che devono essere assorbite tramite le membrane, sono generalmente acidi o basi deboli, che possono cambiare la loro polarità a seconda del pH, essendo così indotte ad essere protonate o meno.

Diffusione e trasporto delle sostanze

La forza in grado di spostare la molecola attraverso la membrana è il gradiente di concentrazione, il quale permette la diffusione della molecola. Questo gradiente è regolato dalla legge di Fick:

ΔC J = K_p s Flusso = (Conc – Conc) x Area x Permeabilità / Spessore Membrana

La diffusione cutanea è molto complicata: prima che venga raggiunta la circolazione sistemica è necessario superare numerosi ostacoli. Lo strato lipidico del derma è in grado di proteggere dalle sostanze tossiche, e permette di sciogliere e bloccare le sostanze lipofile.

Le sostanze inalate, invece, sono in grado di intossicare più facilmente, perché hanno un metodo di scambio molto semplice; una volta assorbita, questa sostanza tenderà a distribuirsi all’interno dei compartimenti lipofili (es. tessuto adiposo).

Il trasporto che viene utilizzato per spostare le molecole può essere:

• Passivo (tra cui trasporto paracellulare e diffusione);
• Attivo, nei quali vengono usate proteine carrier (tra cui diffusione facilitata e trasportatori dei farmaci).

Particolarmente nella diffusione facilitata, sono necessarie delle condizioni favorevoli al passaggio della molecola: per questo motivo è necessario rendere la sostanza polare o non polare, a seconda del pH; un acido debole non ionizzato è in grado di passare le membrane a pH acido e non basico. La caratteristica che differenzia le proteine carrier dalla diffusione semplice è che le prime possono essere saturate, cosa che invece non avviene per la seconda.

Processo di distribuzione

Una volta assorbita la sostanza, e dopo che questa abbia raggiunto la circolazione sistemica, è necessario che si passi dal compartimento primario ad altri compartimenti tramite un processo di distribuzione. Si tratta di un evento che deve essere favorito e coordinato, poiché richiede:

• La capacità di attraversare le membrane;
• Capacità di trasporto di alcune proteine presenti all’interno della circolazione; in questo caso il legame che viene a crearsi tra la sostanza introdotta e la proteina trasportatrice non è covalente, ma impedisce la distribuzione della sostanza: la parte che si distribuisce nel modello è quella che non viene legata.

All’interno della circolazione sanguigna deve sempre essere mantenuto un equilibrio tra la parte libera e la parte legata; questa capacità di legame con le proteine plasmatiche è determinante. La quota libera di xenobiotico, se introdotta tramite via enterale, passa tramite il fegato, organo fondamentale per la tossicocinetica. Tutto ciò che viene introdotto nel circolo sanguigno passa dal fegato, dove avviene l’effetto del primo passaggio: tutte le molecole di xenobiotico subiscono la fase di metabolismo o biotrasformazione, e solo chi sopravvive a questa fase è in grado di essere distribuita nell’intero organismo.

La quota libera dello xenobiotico è l’unica che potrà essere eliminata, tramite i reni oppure altre come la via gastrica.

Inalazione e assorbimento

Un’altra via di esposizione a queste sostanze è quella di inalazione: la capacità di una sostanza di essere assorbita è data da pressioni parziali. In questo caso gli xenobiotici sono sostanze volatili, in grado di essere disciolte all’interno dei tessuti. È importante il raggiungimento dello stato stazionario, punto in cui le pressioni alveolare, sanguigna e tessutale risultano essere uguali, portando ad un equilibrio; il raggiungimento di questa soglia richiede un tempo necessario, e dei fattori che possono modificarlo:

• Ricambio alveolare, sostituzione nell’alveolo dell’aria pulita con quella già introdotta; questo parametro è in grado di variare la capacità del gas di diffondersi nell’organismo in studio. Non è un fattore che dipende dalla sostanza, ma dalle caratteristiche fisiologiche del modello.
• Captazione del gas, dipende dalla capacità del gas utilizzato, e può comprendere la diffusione del gas nel sangue, la gittata cardiaca o il gradiente di concentrazione del gas contenuto nelle arterie o nelle vene. Negli alveoli il sangue venoso cerca un gas, per essere ossigenato; la saturazione di questo sangue è quella che permette una diversa captazione del gas: captazione maggiore se il sangue è venoso e quindi non saturo. Questo fenomeno avviene se la pressione favorisce la captazione del gas nell’alveolo.
• Effetti di differenti tipi di tessuti sulla captazione del gas, dipende dal tessuto che la sostanza vuole raggiungere.

Per determinare la tossicità di una sostanza, è necessario considerare le particelle contenute nell’aria che viene respirata, come le polveri sottili. In base alla dimensione della molecola, è possibile avere un diverso tipo di tossicità: esiste, infatti, una relazione tra la dimensione e la capacità di raggiungere i tessuti più profondi. Questi due aspetti sono direttamente proporzionali: se la dimensione è ridotta, allora è più facile che la sostanza raggiunga gli alveoli; se la dimensione è elevata, può essere intrappolata dal muco e dalle ciglia presenti nella faringe, oppure espulsa tramite starnuti.

Volume di distribuzione

Per la distribuzione è possibile sapere e quantificare il volume di distribuzione: è un dato quantitativamente considerabile come volume, e permette di capire la capacità di una sostanza di distribuirsi all’interno di un organismo. Non si tratta di una connotazione anatomica, poiché la tossicocinetica si occupa di creare dei compartimenti, che possono non avere un corrispettivo fisiologico.

• Volume e distribuzione basse: un piccolo volume indica una scarsa distribuzione; la sostanza rimane nel compartimento centrale.
• Volume e distribuzione alte: la sostanza ha una particolare affinità, o trofismo, per un certo compartimento, e porta a determinare una compartimentalizzazione. Alta quantità non vuol dire uniforme, ma con un’elevata affinità per un dato tessuto; questa compartimentalizzazione specifica permette di complicare il modo di eliminazione.

Dal punto di vista quantitativo, il volume di distribuzione viene calcolato dalla quantità di sostanza a cui è esposto il modello sperimentale (dose) e la concentrazione.

V = Dose / Conc_t t

La concentrazione a cui si fa riferimento è quella presente quando i processi dovuti alla somministrazione della sostanza non sono ancora attivi; si deve quindi identificare un punto in cui i processi siano nulli, in un tempo non misurabile detto t₀, subito dopo la somministrazione.