Tecnologie avanzate per il direzionamento dei farmaci

CICLODESTRINE

Oligosaccaridi ciclici naturali formati da 6, 7 o 8 monomeri di D-(+)glucopiranosio uniti tra loro con

un legame α,1-4 glucosidico e chiusi ad anello. Non sono implicate nel direzionamento attivo, pur

essendo le ciclodestrine degli oligosaccaridi.

Hanno una parte idrofila esterna (zuccheri) e una interna idrofoba e consente l’alloggiamento di

sostanze lipofile. Sono ottimi sistemi per aumentare la solubilità apparente di un farmaco. Sono in

grado di formare composti di inclusione con varie sostanze idrofobe, pur rimanendo solubili in acqua.

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POLISACCARIDI

Hanno origini naturali (alghe, microbi, piante, animali) e hanno il vantaggio di essere molto

abbondanti. Hanno un ampio range di PM (da 10 a milioni di Da). Il vantaggio è che su catene lunghe

ho tantissimi gruppi funzionali derivatizzabili. Inoltre sono biocompatibili e alcuni biodegradabili.

Sono poco immunogenici e non sono tossici.

Tra i polisaccaridi nel drug delivery usiamo:

- Acido ialuronico

- Alginato ricavato dalle alghe

- Chitosano molto utilizzato derivante dall’esoscheletro dei crostacei

CHITOSANO

E’ costituito da due monomeri D-glucosammina e la N acetil D-glucosammina, ci sono 3 punti di

attacco (2 OH e un NH2). E’ caratterizzato dall’avere una carica + per la presenza del gruppo

amminico e il vantaggio è che può interagire con le membrane cellulari (cariche -).

ACIDO IALURONICO

E’usato per il direzionamento tumorale perché riconosce il CD44, altri come l’acido sialico è usato

per il direzionamento verso il SNC, o ancora la glicerrizina che ha siti di legame specifici sulla

membrana degli epatociti. Molti possono essere usati per il direzionamento a livello del colon

(Ciclodestrine, chitosano, destrano con natura diversa)

E’ un fluido viscoso presente nel tessuto connettivo, occhio e fluidi sinoviali. E’composto da acido

glucuronico e glucosammina, è endogeno, biocompatibile, biodegradabile ed è solubile in H2O.

presenta gruppi ossidrilici e carbossilici. Oltre a svolgere funzioni fisiologiche nel movimento delle

articolazioni è importante perché è un ligando del recettore CD44 overespresso in tumori a livello

renale, epatico, mammario, pancreatico. Il CD44 è un recettore che internalizza quando l’acido

ialuronico si lega, formando un endosoma che si apre a livello citoplasmatico, rilasciando il farmaco.

Esempio: nanoparticelle di silice inorganiche, viene caricato un antitumorale e in superficie acido

ialuronico che agisce da direzionante e rende le nanoparticelle biocompatibili. Il legame tra la silice

che ha un gruppo NH2 terminale e il gruppo COOH dell’acido ialuronico formando un legame

ammidico stabile che non ci interessa perché non legato direttamente al farmaco.

Esempio: liposomi legati all’acido ialuronico. Cell tumorali over esprimono il recettore CD44, l’idea

è prendere un liposoma con il farmaco dentro e legarvi l’acido ialuronico. Per legarlo al liposoma si

è scelto di legarlo al fosfolipide dipalmitoilfosfolipiletanolammina dei liposomi. Per direzionare in

maniera più efficace si sostiene che è necessario che il PM sia basso (4800 Da basso rispetto al milione

e mezzo). Il legame è tra NH2 del fosfolipide attraverso un’amminazione riduttiva, si è aperto l’anello

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dell’acido ialuronico con formazione di legame stabile. Questo sistema è stato usato per formare

liposomi ed esporre all’esterno catene di acido ialuronico.

Da un punto di vista dell’attività inserendo un fluorescente nel liposoma si è visto la diversa

captazione tra liposomi come tali e quelli direzionati con acido ialuronico. Si usano due linee cellulari

una che non overesprime il CD44 e una seconda che overesprime il CD44. Quando si mette il

liposoma a 4800 Da si ha un aumento dell’uptake anche a livello di cellule che non lo overesprimono.

Con acido ialuronico di 17000 Da aumenta l’interazione con il recettore, cosa che non avviene con il

controllo negativo.

Si incorpora un farmaco nei liposomi, si è andati a valutare la massa tumorale negli animali in vivo.

Al topo con tumore viene iniettato il farmaco come tale (gemicitabina), quando viene iniettata in

liposomi non direzionanti, aumenta l’attività antitumorale perchè protetto dai liposomi. Se sulla

superficie dei liposomi metto acido ialuronico a 4800 Da non ho un aumento dell’attività

antitumorale, che invece aumenta con acido ialuronico a 12000 Da.

Capitolo 4 PEPTIDI COME AGENTI DIREZIONANTI I

Le proteine sono strutture polimeriche costituite unità monomeriche che si ripetono, sono costituite

da 20 amminoacidi contenenti un gruppo aminico ed un acido carbossilico e, quindi, definiti

aminoacidi.

Il termine aminoacido si potrebbe riferire a qualunque composto organico avente un gruppo aminico

e un acido carbossilico; tuttavia, quando si parla di aminoacidi ci si riferisce genericamente ai venti

aminoacidi selezionati dalla natura per costruire le proteine, definiti aminoacidi proteogenici. In essi

i due gruppi funzionali amminico e carbossilico sono legati allo stesso atomo di carbonio; quindi sono

alfa-aminoacidi.

Il legame che unisce gli aminoacidi per formare peptidi e proteine è un legame amidico e viene

chiamato legame peptidico.

Come tutti i legami amidici, il legame peptidico ha una notevole stabilità e rigidità conformazionale

dovuta al fatto che presenta un parziale carattere di doppio legame a causa della delocalizzazione per

dell’azoto.

risonanza del doppietto elettronico Inoltre, la barriera rotazionale intorno al legame

amidico è sufficientemente alta da impedire a temperatura ambiente la libera rotazione. 17

Un’altra caratteristica comune è che, ad eccezione della glicina, priva di stereocentro per i due H sul

C alfa, sono tutti chirali.

Presentano stereochimica L, secondo la convenzione di Fischer, ossia hanno la stessa configurazione

del carbonio stereogenico della L-gliceraldeide.

Gli oligomeri, costituiti da un numero limitato di aminoacidi (da 2 a 40, il numero massimo non è

rigorosamente definito), si definiscono peptidi.

Parliamo a seconda della lunghezza di:

→

*dipeptidi 2 aminoacidi catena amminoacidica finale con unità N e C terminale

→

*oligopeptidi fino a 40 aminoacidi 18

→

*polipeptidi > 40 aminoacidi

La STRUTTURA PRIMARIA di una proteina o di un peptide è costituita dalla sequenza degli

aminoacidi nella catena.

La STRUTTURA SECONDARIA descrive la formazione di legami idrogeno tra i gruppi CO e NH

dello scheletro polipeptidico di aminoacidi adiacenti nella struttura primaria.

Tre fattori determinano la struttura secondaria:

• la planarità dei singoli legami peptidici

• dal numero di gruppi coinvolti in legami idrogeno

• le interazioni steriche dei vari gruppi tipi: α-elica, β e tripla elica allungata.

La struttura secondaria di una proteina può essere di tre struttura

proteine. E’ determinata da

La STRUTTURA TERZIARIA descrive la forma tridimensionale delle

ponti disolfuro, legami a idrogeno, interazioni elettrostatiche e interazioni idrofobiche degli aa.

Il gruppo SH della cisteina è instabile, viene facilmente ossidato a dare ponte disolfuro. Il gruppo

disolfuro, per riduzione può ridare il gruppo SH.

Quando la sintesi è effettuata chimicamente fuori della cellula, il peptide è noto come peptide

sintetico. ll metodo più comune per ottenere peptidi sintetici è utilizzare la sintesi peptidica in fase

solida, prende questo nome perché la molecola viene legata ad una resina e poi staccata e modificata.

Il problema è che se voglio far reagire COOH e NH2 devo fare una reazione selettiva, in modo che

non reagiscano i gruppi amminici di altri aa. Per questo, gli aminoacidi sono trattati con i gruppi

protettori Fmoc o Boc per proteggerli da reazioni indesiderate e rendere la reazione selettiva. I peptidi

subiscono cicli di accoppiamento e deprotezione ripetuti. Una volta che il peptide è completo, viene

scisso dalla resina e purificato mediante HPLC in fase inversa. 19

Faccio reagire COOH dell’arginina con NH2 della resina e proteggo in modo tale non avere la

formazione della poliarginina (arginina reagisce con arginina). Posso proteggere con due gruppi

protettori diversi, uso agenti condensanti in grado di sottrarre H2O che si forma in seguito alla

reazione di riduzione di un’ammide e fisso il primo aa sulla resina. Continua la reazione e devo

deproteggere il gruppo NH2 FMoc in alfa. Per vedere se si sono formati legami ammidici effettuo il

kaiser test che evidenzia la presenza di ammine libere (in questo caso deve essere negativo perche i

due gruppi amminici sono protetti e quello della resina è impiegato nel legame ammidico). Con una

base debole (pteridina) deprotegge il gruppo amminico del FMoc e mi riporto nelle condizioni iniziali

(un gruppo amminico libero), faccio il KAISER TEST che in questo caso deve essere positivo. Le

fasi successive sono tutte uguali aggiungendo il secondo aa che voglio inserire nella sequenza, faccio

avvenire la formazione del legame ammidico, deproteggo e continuo così.

Mettiamo che si voglia legare un farmaco che deve avere un gruppo che può reagire con NH2. si ha

ancora la molecola legata alla fase solida e poi ho ancora gruppi protetti (NH2) quindi libero il gruppo

amminico e scindo il legame con la resina, rimuovo la resina e ottengo il peptide con la caratteristica

che voglio.

Normalmente i farmaci o le nanoparticelle hanno il problema di avere una scarsa penetrazione nella

cellula o in compartimenti citoplasmatici precisi. Un approccio è sicuramente il legame di queste

strutture con molecole vettore (agenti di targeting anticorpi, peptidi, zuccheri) che permettono di

raggiungere i compartimenti citoplasmatici.

A volte questi sistemi che raggiungono l’endosoma non riescono ad uscirne, e il più delle volte

l’endosoma si acidifica a liposoma e degrada il contenuto. Si è osservato allora che alcune

poliammine stimolavano l’uptake dell’albumina da parte delle cellule tumorali e più analizzando il

virus HIV esso ha strutture policationiche che ne permettono l’ingresso facile nelle cellule. Si è

pensato di sfruttare ciò che avviene in natura per aumentare l’ingresso nella cellula dei farmaci. In

particolare la proteina che nell’HIV permette di facilitare il passaggio è chiamata TAT (transattivatore

di trascrizione), è policationica e aderisce alla membrana in maniera efficiente dato che sono cariche

negativamente. La particolarità di policationi è che aderiscono e inducono la formazione di un poro

che permette l’ingresso del materiale genico del virus ma che non determina morte cellulare.

Sono state fatte delle modificazioni fino a determinar