Tecnologie avanzate per il direzionamento dei farmaci

Tecnologie avanzate per il direzionamento dei farmaci

Capitolo 1: Drug delivery

L’efficacia terapeutica di una sostanza farmacologicamente attiva è, come noto, strettamente legata al suo comportamento farmacocinetico. Un farmaco ideale dovrebbe raggiungere rapidamente ed in quantità sufficiente il proprio organo bersaglio, restarvi per un periodo di tempo sufficiente per esplicare la propria azione terapeutica ed essere invece escluso da altri distretti nei quali potrebbe presentare azioni tossiche. In questo modo, oltre a diminuire gli effetti collaterali, sarebbe possibile anche ridurre la dose somministrata. Tuttavia, molto spesso la distribuzione di un farmaco nell’organismo non è quella desiderata e la frazione di farmaco che arriva al sito target è insufficiente, mentre esso tende ad accumularsi in altri tessuti con conseguenti effetti tossici.

Problemi associati alla somministrazione sistemica di un farmaco

• Solubilità
• Scarso assorbimento (farmaco idrofilo fatica a passare nelle membrane cellulari)
• Biodistribuzione (doxorubicina come antitumorale somministrato come tale può dare effetti collaterali)
• Degradazione in vivo
• Breve emivita plasmatica
• Scarsa specificità per cellula/tessuto/organo malato
• Necessità di somministrare dosi elevate
• Tossicità aspecifica e effetti collaterali

Dipendono da:

• Caratteristiche chimico-fisiche del farmaco
• Caratteristiche chimico-fisiche del sistema di veicolazione
• Via di somministrazione
• Effetto terapeutico desiderato

Perché si richiede un drug delivery?

• Ragioni farmacodinamiche: scarsa specificità e basso indice terapeutico
• Ragioni farmacocinetiche: scarso assorbimento, breve emivita, elevato volume di distribuzione (distribuzione in distretti che non sono siti attivi del farmaco)
• Ragioni farmaceutiche: instabilità e bassa solubilità

Targeted drug delivery (veicolamento direzionato)

Insieme delle tecnologie impiegate per consentire al principio attivo di raggiungere uno specifico sito d’azione, limitando la sua concentrazione in altri distretti. In questo modo si ottengono:

• Concentrazione terapeutica al sito target
• Aumentata efficacia
• Diminuzione della dose somministrata
• Minori effetti collaterali
• Migliori protocolli di somministrazione
• Aumento della compliance del paziente
• Costi più elevati (ad esempio nella doxorubicina si usa come liposomiale che non agisce più sul cuore e ciò richiede costi maggiori)

'Magic bullet': origine di direzionamento

Paul Ehrlich (1854-1915), scienziato tedesco e membro del gruppo di Koch, vincitore del premio Nobel, introdusse il concetto della pallottola magica: conferire specificità ad un principio attivo che ne è privo attraverso il legame con agenti direttori in grado di riconoscere specifiche cellule.

I parametri che determinano l’efficacia del drug targeting sono:

• Le dimensioni del target
• Il flusso sanguigno nel target
• Il numero dei siti di legame per il sistema vettore nel target
• Il numero di ligandi sul vettore
• pH del sito target, temperatura, enzimi, ecc.

Drug targeting

Classificato come:

• Di primo ordine: riferito alla distribuzione del principio attivo in corrispondenza di un organo o tessuto target (es. polmoni, cervello, cavità peritoneale, ecc.)
• Di secondo ordine: riferito alla localizzazione specifica del principio attivo in alcune cellule con caratteristiche diverse (es. cellule tumorali vs cellule sane)
• Di terzo ordine: riferito alla veicolazione del principio attivo non solo in una cellula ma nel compartimento intracellulare delle cellule target (es. endocitosi recettore-mediata, rilascio per degradazione lisosomiale, gene delivery a livello nucleare)

1) Targeting passivo

Consiste nello sfruttare strutture anatomiche (es. fegato con capillari fenestrati) e processi fisiologici per la distribuzione del vettore. Il nostro organismo ha un sistema di difesa e ricopre gli agenti con delle proteine (opsonine), dopo iniezione i nanosistemi vengono ricoperti da componenti del plasma:

• Fibronectina
• Elementi del complemento
• Immunoglobuline

→ Rimossi dal circolo e accumulo negli organi RES (fegato, milza e midollo osseo).

Inverse targeting

Si inverte l’attività dei macrofagi. Blocco dell’attività dei fagociti degli organi RES: si utilizzano sostanze quali il destrano solfato o il metile palmitato, oppure si inietta una prima dose di vettore senza principio attivo per saturare i macrofagi e solo dopo si inietta il farmaco incapsulato nel colloide. Se blocco questo sistema posso però avere problemi dal punto di vista delle difese immunitarie.

Effetto EPR (Enhanced permeability and retention): modificazione della superficie dei nanovettori con polimeri idrofili al fine di renderli “invisibili” ai macrofagi. Questa tecnica è applicata ai nanosistemi, ottenendo delle vescicole a lunga circolazione plasmatica dette Stealth® (accumulo a livello tumorale).

Proprietà dei nanovettori per raggiungere i tumori con meccanismo passivo:

• Eludere la sorveglianza immunitaria
• Dimensioni tra 10 e 100 nm
• Diametro <<400 nm per extravasione delle fenestrature dei vasi tumorali
• Diametro <<10 nm per evitare filtrazione attraverso i reni
• Diametro <150 nm per evitare la cattura specifica da parte del fegato

Limitazioni per raggiungere il tumore con meccanismo passivo:

• Il targeting passivo dipende dal grado di vascolarizzazione del tumore
• L’extravasione dei nanovettori varierà con il tipo di tumore e con la localizzazione anatomica
• L’alta pressione del fluido interstiziale nei tumori solidi impedisce un assorbimento efficace e distribuzione omogenea dei farmaci nel tumore (interessa di più le piccole molecole rispetto ai grandi nanovettori)

2) Targeting attivo

Consiste nell’aumentare la specificità del vettore mediante:

• Approccio biochimico: si va a studiare nella cellula target qualcosa di peculiare, ad esempio si trova un recettore espresso sulla cellula tumorale, troverò un ligando specifico e il sistema andrà a riconoscere solo quel tipo di cellula (la modificazione superficiale attraverso il legame con agenti direttori).

A tal proposito si parla di dual targeting: il ligando ha di per sé attività che si somma a quella del principio attivo, questo mi serve perché posso sinergizzare e ho l’effetto perché le cellule tumorali hanno abilità a trovare un’altra via e un blocco. Il dual targeting permette di bloccare più punti e quindi rendere più difficile la vita della cellula tumorale.

Targeting magnetico rientra nel targeting attivo ma non è un approccio di tipo biochimico. Attraverso la somministrazione di un vettore paramagnetico che è sensibile all’applicazione di un magnete, concentrerò in quel punto il vettore mediante l’applicazione di un campo magnetico extracorporeo.

Altri stimoli esterni

Ultrasuoni, fototerapia per attivare in un certo punto un sistema. È sempre un direzionamento di tipo attivo.

3) Targeting fisico

Sfrutta le caratteristiche del target come le condizioni anomale di pH e/o temperatura (es. tumore, infiammazione) per andare ad attivare il sistema in un certo punto. Tutti i sistemi hanno vantaggi e svantaggi ed esempio il target magnetico permette:

• Alta concentrazione nel sito target
• Scarsa tossicità e si può applicare su qualsiasi parte del corpo

Tuttavia:

• È costoso
• Ha tossicità a lungo termine (es. magnetite)

Quali stimoli si possono applicare?

• Sonoforesi: permette il passaggio della barriera cutanea tramite l’utilizzo di ultrasuoni
• Mancanza di ossigeno: sfruttato per il direzionamento

Per quanto riguarda il targeting fisico, i principali agenti sono calore, campo magnetico, ultrasuoni, campo elettrico e sono stati applicati a diversi sistemi come liposomi, polimeri. Succede che attraverso l’applicazione di tali sistemi si ha un cambiamento di permeabilità e facilito il rilascio del principio attivo a destinazione.

In campo tumorale sono molto studiati il targeting dell’ambiente che circonda il tumore (ad esempio il circolo sanguigno), quindi non è detto che io vada a direzionare verso una cellula; perciò direziono a livello dei vasi sanguigni.

Targeting all’endotelio vascolare

I nanovettori targati dai ligandi specifici si legano e uccidono i vasi sanguigni angiogenici e indirettamente le cellule tumorali che questi nuovi vasi supportano, soprattutto nel centro del tumore. I vantaggi del targeting all’endotelio tumorale sono:

• Non è necessario lo stravaso di nanovettori per arrivare al loro bersaglio
• Il legame ai loro recettori è direttamente possibile dopo iniezione endovenosa
• Minore rischio potenziale di sviluppare resistenza a causa della stabilità genetica delle cellule endoteliali rispetto alle cellule tumorali
• La maggior parte dei bersagli delle cellule endoteliali sono espressi qualunque sia il tipo di tumore, offrendo uno spettro di applicazione più ampio

Si prendono in considerazione gli elementi:

• Target: cellula/tessuto/organo bersaglio dell’attività del principio attivo (non deve essere ubiquitario)
• Carrier: vettore che veicola/incorpora il principio attivo e lo trasporta fino al target (può essere legato al farmaco o incorporato fisicamente). I vettori possono essere esogeni (carrier polimerici, sono sistemi più uniformi ma sono più tossici perché stimolano risposta dell’organismo) o endogeni (HDL, LDL, eritrociti, albumina)
• Ligando/agente direttore: molecola che conferisce specificità e che riconosce in modo selettivo il target (anche dopo derivatizzazione)

Requisiti del drug delivery system

• Inerte, biocompatibile, biodegradabile, non tossico e non immunogenico
• Stabile chimicamente e fisicamente in vitro e in vivo cioè non deve essere idrolizzato, non deve precipitare ecc.
• Specifico
• Rilascio graduale del principio attivo solo al sito target e non durante la biodistribuzione, questo permette anche un migliore effetto terapeutico evitando i picchi di concentrazione
• Applicabile a livello industriale in termini di costi e di strumentazione

Due strategie principali

• Modificazione chimica del principio attivo che viene liberato in vivo per idrolisi chimica o enzimatica (prodrug)
• Legame con piccola molecola o con polimero prodrug → molecola inattiva prima della scissione del legame e viene attivato (minor tossicità verso cellule sane)
• Incorporazione fisica in un vettore (protezione) quindi non genero alterazioni e soprattutto lo posso proteggere e renderlo inaccessibile a sistemi che lo idrolizzano o enzimi che lo degradano, lo svantaggio è che non può essere incorporata una grande quantità di farmaco

È importante la chimica di legame: il sistema deve essere stabile ma deve poter essere scisso a un certo punto. Normalmente si ha un farmaco, si usa un legame scindibile, uno spaziatore affinché il ligando interagisca bene con il recettore e un ligando (che è un agente di direzionamento).

Diverso è il discorso se si utilizza vettori particolati. In questi sistemi oltre alla protezione fisica si può incorporare più farmaco (nel serbatoio) e a differenza del prodrug non ho più un rapporto 1:1 tra agente di vettore e la molecola. Quindi ho una struttura in cui all’interno ho il farmaco e all’esterno ho i ligandi che permettono di stabilire delle interazioni multiple ed è importante con recettori presenti come raggruppamenti (cluster). Se ho più recettori, non interagiranno tutti nello stesso momento, perciò il tempo di interazione sarà prolungato e con esso anche il rilascio. Quindi non è più importante un sistema che sia idrolizzabile anzi è meglio avere un sistema il cui legame sia stabile per permettere al farmaco di uscire. È importante la quantità di ligandi per superficie sufficiente per ottenere una interazione prolungata.

In generale i sistemi carrier si possono dividere in:

• Sistemi a base lipidica (liposomi, microemulsioni, nanoparticelle solide-lipidiche)
• Sistemi a base polimerica (nanoparticelle, nanogel, micelle, dendrimeri)
• Carrier inorganici (a base di metalli, es. nanoparticelle d’oro, di silice) tuttavia danno tossicità a causa della difficoltà di eliminazioni

Liposomi

Sono vescicole formate da fosfolipidi strutturati in bilayer delimitanti uno o più compartimenti acquosi nel loro interno. I fosfolipidi orientano le teste idrofile nelle regioni superficiali a contatto diretto con il solvente polare e le code idrofobiche negli strati più interni del doppio strato, a costituire una fase idrofobica separata dal solvente polare circostante. I liposomi possono essere uni- o multilamellari a seconda del numero di bilayer. Il vantaggio è che il farmaco incorporato può essere idrofilo, lipolifo o anfifilico.

Nanoparticelle

• Sistemi colloidali (elevata superficie specifica)
• Dimensioni submicroniche costituite da polimeri di origine sintetica o naturale o da lipidi
• Forma sferica utilizzabili per il trasporto di principi attivi (diversi sistemi di rilascio)
• Somministrazione in mezzo acquoso modificazione del profilo farmacocinetico (rilascio prolungato) e della biodistribuzione
• Protezione del farmaco dalla degradazione nell’organismo
• Diminuzione della tossicità aspecifica
• Diverse vie di somministrazione (e.v., orale, oculare, ecc.)

Sono sistemi più stabili rispetto ai liposomi.

Dendrimeri

Macromolecole monodisperse con una caratteristica forma tridimensionale ramificata simile a quella di un albero. Nella struttura di un dendrimero si definiscono tre regioni: la parte centrale, detta core, da cui si diramano i dendroni che sono costituiti dalla ripetizione di unità monomeriche nelle tre direzioni spaziali, e la ‘periferia’ formata dalle appendici finali dei dendroni che possono essere inerti o portatrici di gruppi funzionali: possono incorporare il farmaco fisicamente nelle cavità o legarlo covalentemente grazie ai numerosi gruppi funzionali. Il vantaggio è che non ho più un rapporto 1:1 ma per ogni dendrimero leggo più farmaco. Indicando il numero di generazione identifico la lunghezza del dendrimero.

Capitolo 2: Acido folico come agente direzionante

Il folato è l’acido folico legato. In mezzo può essere un pone con un legame idrolizzabile (ed esempio di targeting, i due gruppi COOH) cioè il farmaco per agire deve essere separato dall’agente o non idrolizzabile se ho il target legato al vettore che contiene in farmaco, quest’ultimo può essere rilasciato senza che ci sia scissione.

L’acido folico (acido pteroil glutammico) è di per se la vitamina:

• È una polvere gialla
• È una vitamina del gruppo B, detta vitamina Bc o B9
• Ha peso molecolare pari a 441,4 Da, cioè ha un PM basso
• Deve il suo nome al termine latino folium, poiché inizialmente fu isolato dalle foglie di alcuni vegetali (1942)

Caratteristiche chimico-fisiche

• Solubilità: la forma non ionizzata dell’acido folico è poco solubile in acqua, mentre il sale disodico mostra una solubilità maggiore. L’acido folico è anche poco solubile nella maggior parte dei solventi organici, eccetto in dimetilsolfossido ed in dimetilformamide che hanno un alto punto di ebollizione. La solubilità è importante per permettere il legame a qualcosa.
• Stabilità: l’acido folico è sensibile alla luce, al calore ed al pH acido. Le sue soluzioni mostrano un massimo di stabilità a pH fisiologico 7,6. → attenzione all’articolo, ricordare che si lavora a pH 7.

In natura l’acido folico si trova in diversi cibi, soprattutto nel fegato, nei vegetali verdi freschi a foglia e nella frutta. Nelle cellule eucariote l’acido folico, non è prodotto dal nostro organismo, interviene in importanti processi metabolici, in particolare come co-enzima in reazioni in cui vengono trasferite singole unità carboniose (CH₃) e nella sintesi ex novo di nucleotidi e di acidi nucleici, come DNA e RNA.

Meccanismo di reazione

L’acido folico è introdotto con la dieta e trasformato in Metiltetraidrofolato che cede CH₃ alla vitamina B12, per sottrazione di un metile si forma il Tetraidrofolato che viene ridotto e partecipa alla sintesi di purine e pirimidine e di DNA e RNA. La carenza di acido folico nella dieta può provocare gravi disturbi, quali anemia megaloblastica, glossite, diarrea e perdita di peso. Particolarmente pericolosa è la carenza nella donna in gravidanza, poiché può provocare malformazioni neonatali come la spina bifida (reazione di un canale laterale nella schiena del bambino che può riempirsi di liquido, ingrossarsi e addirittura il cordone neuronale può uscire e occupare questa bolla). Un recente studio condotto su topi sprovvisti dei recettori folico dell’acido ha infatti evidenziato lo sviluppo di fatali anomalie morfogenetiche.

Recettore dell’acido folico

Poiché le cellule animali non posseggono gli enzimi chiave per la biosintesi dell’acido folico, la loro sopravvivenza e la loro proliferazione dipendono dalla loro abilità ad acquisire ed utilizzare la vitamina introdotta con la dieta. La permeabilità delle membrane cellulari al folato, a causa della presenza di specifici recettori, è cruciale per il direzionamento efficace e specifico di farmaci o agenti terapeutici. Questi recettori, espressi in maniera elevata su cellule tumorali, rendono il folato un candidato ideale per il targeting di sistemi di drug delivery coniugati.