Tecniche e allestimento campioni istologici

Processo di preparazione dei campioni per la microscopia ottica

Coloranti vitali non richiedono fissazione:

Tripan blue: Le cellule possono essere colorate senza fissazione e sono quindi solo minimamente alterate dal trattamento.

Hoechst: Coloranti fluorescenti per colorare selettivamente strutture cellulari diverse.

Coloranti che richiedono fissazione:

Allestimento di campioni istologici per la microscopia ottica:

1. Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm³): Biopsia, intervento chirurgico, autopsia postmortem. Prelevato rapidamente utilizzando strumenti adatti (bisturi).
2. Fissaggio del campione: generalmente per mezzo di aldeidi reattive (formaldeide); cross-link delle macromolecole, in particolare le proteine; si previene l'autolisi e la putrefazione e si rende il preparato stabile nel tempo.
3. Disidratazione del campione: Bisogna rimuovere l'acqua per poter infiltrare la paraffina (materiale usato per l'inclusione). Si

sostituisce gradualmente l'acqua con etanolo- Si elimina l'etanolo immergendo il campione in xilolo perchè ?La paraffina non è solubile nemmeno nell'etanolo

INCLUSIONE: è necessaria per poter ottenere fettine sottili

Esistono diversi mezzi di inclusione che conferiscono diversa consistenza ai campioni:

• PARAFFINA
• RESINA
• MIX DI PARAFFINA E RESINE

Inclusione

La paraffina occupa lo spazio precedentemente occupato dall'H2

La paraffina fredda si indurisce e permette di sezionare il campione

Taglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10µm.

Montaggio delle sezioni su vetrini per microscopia.

Colorazione

I coloranti sono a base acquosa, bisogna eliminare la paraffina

Si immerge il vetrino in xilolo e poi in etanolo a concentrazione decrescente, infine in acqua

Colorazione con un colore brillante di certe componenti del tessuto

Contro colorazione del resto del tessuto con un colore contrastante

Ematossilina

Eosina- Ematossilina ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine).

Eosina ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol).

Ematossilina colora di blu/porpora, la colorazione viene detta BASOFILA.

Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili.

Eosina colora in rosso/arancio/rosa, la colorazione viene detta ACIDOFILA o detta EOSINOFILA.

Sono proteine del citosol.

Altre colorazioni:

• PAS: Per sostanze ricche in zuccheri (muco) Adiposo Bianco
• Tricromica (Azan-Mallory): Colora i connettivi. Le aree bianche sono lipidi.
• Osmio o Sudan black: Per grasso/lipidi/mielina. I lipidi non incorporano coloranti acquosi. Mielina.
• Argento ed oro: Per fibre delicate e processi cellulari.
• Giemsa: Cellule nervose. Per le cellule del sangue. Simile ad E&E. Cellule del sangue.

E le aree "bianche"? I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi.

interstiziali non si colorano con E&E (sangue, linfa etc.)

Si riconoscono come ampi spazi bianchi

Anche i lipidi ed il grasso non si colorano

Interpretate il campione!!!

Dovete pensare in 3 dimensioni

Sezioni seriali sono l'ideale per l'interpretazione e la ricostruzione

Ricostruzione per mezzo di sezioni seriali

Interpretate il campione !!!

"Artefatti"

Shrinkage

Disidratazione e fissaggio

Lascia dello spazio aggiuntivo

Fratture al piano di taglio

Lama deteriorata

Tagli netti e ben visibili

Colorante precipitato

Macchie di colore a "grano di pepe"

Tessuto "pinzato"

Strumento per l'excisione deteriorato

Pieghe durante il montaggio

Preparazione tramite congelamento- Una tecnica alternativa alla fissazione e all'inclusione è il congelamento- La tecnica più usata per effettuare il congelamento è l'esposizione all'azoto liquido

(-196 °C) - Accorciamento dei tempi di allestimento di preparati istologici - Utilizzato durante un'operazione - UTILIZZATO UN MICROTOMO IN COMBINAZIONE CON UN CRIOSTATO (-20 °C)

Preparazione di Campioni Biologici per TEM

Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm³)

Fissaggio del campione con glutaraldeide e tetrossido di osmio

L'osmio è un metallo 'pesante che si lega ai lipidi, rendendoli elettrondensi (neri)

Disidratazione dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo.

Inclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina.

Taglio con ULTRA-MICROTOMO con lama al diamante (a volte vetro). Lo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito 65-80 nm).

Montaggio delle sezioni su di una griglia.

Colorazione delle sezioni - nitrato o acetato di uranio e citrato di piombo

Visualizzazione al TEM

Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini

Preparazione di Campioni Biologici per SEM

SEM fa una scansione della superfice del campione e produce

immagini 3-D

Non vengono registrati gli e- che attraversano il campione ma quelli secondari che sono emessi a seguito dell'urto del fascio di elettroni contro di esso