Tecniche diagnostiche molecolari: transgenesi, northern blot, ibridazione in situ e immunoistochimica.

TECNICHE DIAGNOSTICHE MOLECOLARI

Transgenesi

Si utilizza questa tecnica per identificare/evidenziare gli elementi regolatori della trascrizione tessuto-

si basa sull’inserimento di un gene esogeno nel genoma.

specifica:

Fusione di geni reporter e sequenze di DNA con i geni che vogliamo studiare – con regioni che si

sospetta contengano enhancer (o altri elementi regolatori della trascrizione). Il transgene ottenuto viene

inserito in un embrione.

Se la sequenza contiene un elemento regolatore, allora il gene reporter si attiverà in un tempo e in una

posizione specifica.

I fattori di trascrizione specifica, insieme ad altri fattori di trascrizione (come TAF o TFIIB),

• possono attivare i geni e facilitare la trascrizione: aprono i nucleosomi e stabilizzano il

complesso di trascrizione.

Gli enhancer sono sequenze di DNA che attivano e controllano il grado di trascrizione del

• promotore: sono cis agenti e possono agire a grandi distanze.

I geni reporter possono essere identificati facilmente e non producono

• effetti sulla cellula. +

A. gene codificante per Myf-5 (proteina muscolare specifica) gene reporter

della β-galattosidasi.

Il gene lacZ della β-galattosidasi di E. coli può essere utilizzato come gene

reporter e fondersi con un enhancer che dirige l’espressione di particolari

muscoli nel topo. Il transgene ottenuto viene iniettato in un ovocita di ratto

appena fecondato e incorporato del suo DNA, la β-galattosidasi sarà visibile

nelle cellule muscolari dei muscoli dell’occhio, facciali, del collo, degli arti

anteriori e del miotomo segmentato (schiena).

+

B. gene codificante la cristallina gene reporter della GFP (proteina

fluorescente verde).

GFP è visibile solo nel cristallino di Xenopus tropicalis: presenza di enhancer.

C. Il gene Pax6 di ratto viene espresso nel cristallino, nella retina, nel tubo neurale e nel pancreas.

* Se una proteine viene sintetizzata in vari tessuti può avere diversi regioni enhancer separate, che

dirigono l’espressione genica in diversi siti.

La mappa dei siti enhancer del gene Pax6 è basata sullo studio del gene reporter lacZ.

§ Il gene ha due promotori principali (esone 0 e 1) e ognuno può iniziare la trascrizione dello

stesso RNA.

§ Il codone di inizio della traduzione è nell’esone 4.

§ La sequenza enhancer a monte del gene, dirige l’espressione del transgene reporter lacZ,

nell’ectoderma superficiale che ricopre la cupola ottica (colorazione scura dell’area).

§ Ci sono 4 sequenze enhancer che attivano il gene ed ognuna corrisponde ad un organo diverso,

dove si agirà la proteina(vedi immagine).