Tecniche diagnostiche molecolari: transgenesi, northern blot, ibridazione in situ e immunoistochimica.

Northern blot

l northern blot è una tecnica che permette di visualizzare ed identificare l'RNA purificato da un

campione per studiare l'espressione genica.

* Simile al Southern Blotting, tecnica analoga che studia il trasferimento di DNA, con la differenza

sostanziale che l'RNA tende a formare strutture secondarie stabili in soluzione;

1) Si estrae l’mRNA da ciascun tessuto dell’embrione e si denatura.

bisogna uccidere l’embrione e sezionarlo.

*Problema:

2) Si denatura l’RNA per mantenerlo privo di strutture secondarie.

3) L'elettroforesi in gel di agarosio permette di frazionare l'RNA in base al peso molecolare, e quindi

in base alla lunghezza.

Per visualizzare l'RNA durante l'elettroforesi, si può utilizzare l'etidio bromuro, che si lega

debolmente all'RNA ed emette luce fluorescente quando esposto a luce ultravioletta.

* RNA/DNA hanno una carica negativa e corrono verso il polo positivo.

4) L'RNA viene trasferito su una membrana di nylon utilizzando il fenomeno della capillarità.

5) Ibridizzazione: si utilizza una sonda di DNA, cioè una sequenza di DNA complementare all'RNA

da identificare.

* La sonda è spesso marcata con un isotopo radioattivo in modo da poter essere visualizzata

esponendo la membrana ad una lastra fotografica.

In questo modo possiamo capire dove viene espresso il gene che vogliamo studiare: infatti, il gene è

presente in tutte le cellule, mentre l’mRNA è trascritto solo nelle cellule (e quindi i tessuti) in cui

questo si esprime.

* Tecnica complicata perché tutto il procedimento deve essere fatto al buio, in camera oscura.

Ibridazione in situ

Tecnica applicata direttamente sul tessuto dell’embrione, in modo da evitarne il sezionamento.

E’ l’unica tecnica che permette di localizzare l’espressione di un dato mRNA a livello delle singole

cellule: ideale per studiare i geni espressi in un gruppo ristretto di cellule all’interno di un

tessuto.

Es: l’mRNA di Pax6 non è presente in tutta la retina ma solo nelle cellule situate nelle regioni a

contatto con il cristallino.

Si utilizzano sonde marcate di DNA complementari al RNA bersaglio, che vendono deposte

direttamente sul tessuto.

Le sonde sono marcate con digossigenina.

1) Una volta trattato l’embrione con la sonda marcata si lava e si tratta con anticorpi anti

2) digossigenina marcati con la fosfatasi alcalina.

Si risciacqua e si aggiunge un substrato fosforilato.

3) A questo punto avremo la colorazione solo dove le sonde si saranno ibridate al mRNA.

4)

5) L’ibrido sonda-bersaglio è osservabile mediante microscopio elettronico.

* Tecnica difficile perché RNA è una molecola molto instabile.

La presenza dell’mRNA non assicura che venga poi tradotto in proteína (a causa del sistema di

controllo). Per cercare una determinata proteina in una cellula o in un tessuto usiamo la tecnica

dell’immunoistochimica.