Tecniche di laboratorio - Gene targeting e Lineage tracing

Topi knock in/out

Per capire quali molecole sono presenti nei processi di attivazione/quiescenza studio knock out dei topi, in cui sono disattivati dei geni.

Selezione del gruppo di molecole

1. Selezionare il gruppo di molecole che è probabile siano coinvolte nel processo (es. le BMP sono espresse in modo ubiquitario nel mantenimento dell’omeostasi e sviluppo dei tessuti).

Osservazione dei knock out

• Si osservano i knock out.
• Si capisce quali cellule producono una determinata molecola e se quella molecola è importante per l’omeostasi e generazione di un certo tessuto attraverso la GFP.

Espressione del gene d'interesse

Per capire dove è espresso un gene d’interesse, si utilizzano le cellule staminali pluripotenti del topo che si possono auto-rinnovare anche in vitro. Possiamo utilizzare l’immunofluorescenza (ma non è sempre facile avere anticorpi contro una data proteina).

Gene targeting

Il gene targeting sfrutta la ricombinazione omologa, un processo che avviene normalmente all’interno di una cellula, ma con un’efficienza bassa. Si tratta di un processo di riparo del DNA altamente fedele utilizzando l’altro allele presente nel punto di rottura. Questo processo può essere sfruttato per inserire delle sequenze di DNA all’interno di un gene di interesse.

Nelle cellule staminali, quindi, viene inserita una sequenza di DNA che contiene sequenze identiche a quelle presenti su un sito di interesse (endogena). Al posto di questo gene verrà trascritta la GFP. Guardando la fluorescenza si può capire dove questo gene viene espresso.

• Queste cellule vengono poi impiantate nella blastocisti
• Formano tessuto chimerico (cellule Wild Type + cellule modificate)