Il valore di trasmittanza e assorbanza
Il valore di trasmittanza è T = I/I0, quello percentuale è T% = 100T. L'assorbanza è A = log101/T = log10(I0/I). Ogni campione molecolare ha un proprio valore di assorbanza associato alla propria lunghezza d'onda, che lo distingue da altri campioni.
Le cuvette
- In vetro o plastica per il visibile
- In quarzo per lunghezze d'onda UV o visibile
Spettrofotometria UV-visibile
Il valore di assorbanza indica la λ assorbita dal campione, sostituita dal colore opposto a quello di partenza nello schema dei colori per lo spettro visibile.
La legge di Lambert-Beer permette il calcolo della concentrazione (c) di un campione puro a partire dalla sua A. A = ε x l x c.
Biochimica e determinazione della concentrazione di soluzione proteica
È necessario:
- Costruire la curva di calibrazione
- Misurare O.D
Per costruire la curva di calibrazione è necessario preparare i saggi di Bradford con il Coomassie Brilliant Blue ed effettuare le misure di λ con lo spettrofotometro. Dalla retta di calibrazione è possibile fare una stima della concentrazione del campione non puro in soluzione.
Stime approssimative
- Purezza del campione: confronto P con I
- Quantità del campione: confronto P con i valori BSA
Determinazione del peso molecolare delle proteine
Applicazione dell'elettroforesi SDS-PAGE. Confronto P con i M.
Per quest'ultimo parametro si utilizza l'indice. Si utilizza per ulteriore controllo a seguito della purificazione delle Rf = migrazione proteine (mm)/ Dye migration (mm) (il valore più alto, sul fondo del SDS-PAGE), dopo di che si controlla sulla curva di calibrazione il valore di interesse.
Velocità di migrazione
È direttamente proporzionale a:
- Campo elettrico applicato
- Carica della molecola
Inversamente proporzionale a:
- Viscosità del mezzo
- Dimensioni della molecola
SDS-PAGE: colorazione e decolorazione del gel
- Liberare il gel dai vetrini
- Far scivolare in una soluzione colorante
Tecniche di visualizzazione delle proteine
- Introdurre il gel in una soluzione decolorante per alcune ore
- Coomassie staining
- Silver staining (più preciso ma più complesso)
Composizione running gel
- 11% Acrilammide: bisacrilammide 29:1
- 1X running gel buffer Tris-HCl pH 8.8
- 0,1% SDS
SDS-PAGE o gel discontinuo
- 0,1% APS
- Forma per polimerizzazione radicalica
Elettroforesi per SDS-PAGE
Il supporto per l'elettroforesi di proteine:
- TEMED tramite APS e TEMED gel di acrilammide
Biochimica II: composizione stacking gel
Ci sono due strati del SDS-PAGE:
- 3,5% Acrilammide: bisacrilammide 29:1
- 1X stacking buffer Tris-HCl pH 6.8
- 0,1% SDS
- 0,1% APS
- TEMED
Elettroforesi SDS-PAGE: allestimento della corsa
Allestire l'elettroforesi:
- Prelevare i campioni da analizzare
- Caricarli nei pozzetti e avviare l'alimentatore a 25/mA/120 V
Preparazione del campione
- Si aggiunge sample buffer (soluzione denaturante e riducente):
- 60mM buffer Tris/HCl a pH 6.8
- 2.5% SDS
- 5% β-mercaptoetanolo
- 10% glicerolo
- 0,002% bromofenolo
- + 4 μl di sample buffer 4X
- Incurvare a 100%
Struttura agarosio
D-galattosio unito a 3,6-anidro-L-galattosio. Matrice gelatinosa con pori di circa 200nm di diametro.
I DNA di corsa possono essere:
- Ogston Sieving
- Reptation
- DNA circolari
- DNA circolari con più super avvolgimenti (ΔLk = 1)
Preparazione gel agarosio
Agarosio + TAE buffer e intercalante in preparato lo stampo e gli elementi da inserire si:
- Stampo con pettine per formare i pozzetti
Separazione di molecole di DNA mediante elettroforesi
Su gel di agarosio
- Caricamento campioni: Maker di taglia, PCR o digestione analitica
- La digestione analitica si prepara con corsa elettroforetica: 70V
- Visualizzatore DNA al transilluminatore
La PCR
- Buffer Green
Si può conoscere il peso molecolare e la quantità di DNA tramite:
- Maker di taglia (peso molecolare)
- Proporzione del campione rispetto ai marker da taglia che indicano la quantità di DNA
- Retta di calibrazione (specifica per il peso)
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