Tecniche di laboratorio biologico - schemi

VELOCITÀ DI MIGRAZIONE E:

direttamente proporzionale a- campo elttrico applicato- carica della molecolainversamente proporzionale a- viscosità del mezzo- dimensioni della molecola

SDS-PAGE:

colorazione e decolorazione del gel- liberare il gel dai vetrini- far lo scivolare in una soluzione colorante

TECNICHE DI VISUALIZZAZIONE DELLE PROTEINE:

introdurre il gel in una soluzione decolorante per alcune ore

COMPOSIZINE RUNNING GEL:

Coomassie stainig - 11% Acrilammide: bisacrilammide 29:1- Silver stainig (più reciso ma più complesso) - 1X running gel buffer Tris-HCl pH 8.8- 0,1 % SDS

SDS-PAGE O GEL DISCONTINUO:

0,1 % APSSI FROMA PER POLIMERIZZAZIONNE RADICALICAELETTROFORESI PER SDS-PAGE Il supproto per l'elettroforesi di proteine: - TEMEDTRAMIT APS E TEMED gel di acrilammide

COSTITUENTI:

BIOCHIMICA II: COMPOSIZIONE SACKING GEL- cella elettroforetic Ci sono duue strati del SDS-PAGE - 3,5% acrilammide: bisacrilammide 29:1

ELETTROFORESISDS-PAGE: ALLESTIMENTO

DELLA CORSA - stacking gel- alimenntatore - 1X stacking buffer Tris HCl pH 6.8-e running gel- allestire l'elettroforesi - supporto poroso - 0,1% SDS-prelevare i campioni da analizzare - 0,1% APS- caricarli nei pozzetti e avviare l'alimentatore a 25/mA/120 V - TEMEDPPREPARAZIONE DEL CAMPIONE-si aggiunge sample buffrer (soluzione denaturante e riducente)-60mM buffer Tris/HCl a pH6.8-2.5% SDS-5% β-mercaptoetanolo- 10% glicerolo-0,002% bromofenolo- + 4 μl di sample buffer 4X- incurbare a 100%STRUTTURA AGAROSIO:D-galattosio unito a 3,6-anidro-L-galattosioMatrice gelatinosa con pori di circa 200nm di diametro. I DNA DI CORSA POSSONO ESSERE:- Ogston Sieving o- Repptation- DNA CIROLARI- DNA circolari con più super avvolgimenti ( ΔLk = 1) PREPARAZIONE GEL AGAROSIO:- AGAROSIO + TAE BUFFER E INTERCALANTE IN PREPARATO LO STAMPO E GLI ELEMETNTI DA INSERIRE SI- stampo con pettine per formare i pozzettiSEPARAZIONE DI MOLECOLE DI DNA MEDIANTE ELETTROFORESI PROCEDE CON:SU

GEL DI AGAROSIO - caricamento campioni:

Maker di taglia, PCR o digetstione analitica

LA DIGESTIONE ANALITICA SI PREPARA CON:

• corsa elettroforetica: 70V
• 20μl di campionne + X 2 μL di Loading DYE 10 X (che é un buffer)
• visualizzatore DNA al transilluminatore

LA PCR CON:

• buffer Green

SI PUò CONOSCERE IL PESO MOLECOLARE E LA QUANTITA' DI DNA TRAMITE:

• macher di taglia (peso molecolare)
• proporzione del campione rispetto ai marker da taglia che indicano la quantità di dna
• retta di calibrazione (specifica per il peso)

BIOLOGIA MOLECOLARE 2:

DIGESTIONE DEL DNA CON ENZIMI DI RESTRIZIONE

ELETTROFORESI DI DNA

ENZIMI DI RESTRIZIONE

CALCOLO DELLE bp DEL DNA

CALCOLO Vi PERREAZIONE PER LA DIGESTIONE DEL PLASMIDE pDSP CON HindIII in 20μl

ALCUNI ENZIMI DI RESTRIZIONE:

• HindIII
• HincII
• NspI
• Eco RI Sito attivo : Mg2+

APPLICAZIONI:

• identificazione di batteri o virus in uomo
• identificazione di oganismi geneticamente modificati
• analisi DNA in medicina legale
• Diangnosi

prenatale di malattie genetiche- diagnosi di malattie tumorali- clonaggio e sequenziamento del prodotto di PCR

REQUISITI:

• DNA a doppio filamento o singolo
• primer forward
• primer reverse
• polimerasi (Taq)
• Buffer verde

BIOLOGIA MOLECOLARE - H2O

PCR - dNTP

Template

TECNICA:

MACHINA: termociclatore

diversi cicli termici che comprendono l'anilazione e la denaturazione del DNA

temperatura di Melting: Tₘ = nGC x 4 + nAT x 2

Calcolo volumi iniziali tramite le formule

Ci x Vi = Cf x Vf

a : 1 = b : x

ESAPODA: CLASSE INSECTA DI INTERESSE

ARTERIGOTA

CARATTERISTICHE GENERALI:

• TESTA (CON ANTENNE E OCCHIO COMPOSTO)
• TORACE
• ADDOME
• INTERNAMENTE:
• MASSA GANGLIARE CEREBRALE
• CAVO INTESTINALE
• TUBI MALPIGHIANI
• CUORE
• SISTEMA TRACHEALE
• OVARIO
• MANDIBOLA
• ORGANO SESSUALE

Classificazione alternativa (Binomiale di Linneo)

TIPO DI INTERESSE: ARTHROPODA

CARATTERISTICHE:

• ARTI ARTICOLATI
• ESOSCHELETRO CON CUTICOLA: TERGITI, STERNITI E PLEURITI
• ETOLES
• VILUPPO PER MUTA O ECDISI
• INTESTINO MEDIO
• VASO DORSALE
• CORDONE NERVOSO VENTRALE
• SUBFILA

DI INTERESSE: ESAPODI

Albero filogenetico animali

Gli animali sono comparsi 600 M di anni fa a partire da un ¹protista ancestrale protista coanoflagellato ²parazoi /eumetazoi ³dagli eumetazoi : radiati / bilaterali ANIMALI:EUCARIOTI , PLURICELLULARI, ETEROTROFI CON TESSUTI ⁴ dai bilaterali: acelomati/ celoma ESCLUSIVI SVILUPPO EMBRIONALE CON DUE O ⁵tipi di celoma: pseudodelomati/ celomati TRE FOGLIETTI GERMINATIVI ⁶celomati: protostomi/vari lofoforati /deuterostomi REGNI DEGLIESSERI VIVENTI:MONERAPROTISTIPIANTE FUNGHIANIMALI TRE DOMINI: ¹ BACTERIA ² ARHAEA ³ EUKARYA

Caratteristiche degli animali

CEPPI POSSONO ESSERE- prototrofi TERRNENI MINIMI E CEPPI AUXOTROFI VENGONO UTILIZZATIo PER LA SELEZIONE DI MUTANTI- auxotrofi PREPARAZIONE TERRENO MINIMO:Terreni possono essere: - 1,9 gr di YNB in un l di H₂O- YPD complessi - NH₂SO₄ (5 gr per l)- YNBD , minimi - amminoacidi 0,5 -1 ml per 100 ml di terreno- basi azzotate 0,5 ml per 100 ml di terren- sintetici

GENETICA MICROBICA - fonte

di C al 2%

ESERCITAZIONE II

identificazione dei marcatori di auxotrofie

MATERIALE PER CAMPIONI INCLUSI IN PARAFFINA:

• materiale vegetale incluso in paraffina o sezionato
• vaschette per colorazione
• H2O distillata
• coloranti

BOTANICA - Safranina 1% in alcol etilico 70%

PREPARAZIONE DI SEZIONI SOTTILI

FASI DELL'INCLUSIONE:

• fast green 0,05% in alcol etilico assoluto
• infiltrazione IN MEZZI DI INCLUSIONE
• vetrino porta-oggetto-indurimento (polimerizzazione)
• vetrino copri-oggetto

PROCEDURE:

• carta assorbente
• prelievo
• fissazione

FISSATIVI CHIMICI SI DIVIDONO IN:

• fissativi che coagulano le proteine - disidratazione
• fissativi che non coagulano le proteine - chiarificazione
• fissativi semplici - inclusione in paraffina / resina
• miscele fissative - sezionamento al microtomo

FISSATIVI VENGONO MISCELATI CON TAMPONI:

• raccolta delle sezioni sul vetrino portaoggetto
• isotonici
• leggermente ipertonici - sparaffinatura ( per mezzo di xiolo, seguito da etanoloper l'allontanamento

dell'intermediario)- colorazione

I PREPARA VANNO LAVATI CON:

• acqua corrente
• montaggio delle sezioni colorate
• in soluzioni tampone

DOPO IL LAVAGGIO SI HA LA DISIDRATAZIONE CON:

MEZZI DI INCLUSIONE POSSONO ESSERE:

• concentrazione crescente di alcool o di acetone
• paraffine:
• molli
• o dure

LA DISIDRATAZIONE VIENE PRECEDUTA DALLA CHIARIFICAZIONE, I ALTRI MEZZI DI INCLUSIONE SONO

CHIARIFICANTI POSSONO ESSERE:

• resine epossidiche
• xiolo o xilene
• celloidina
• toulene
• benzolo
• cloroformio

3) LAVAGGIO

2) FISSAZIONE

10) MONTAGGIO DEL

VETRINO COPRIOGGETTO

4) DISIDRATAZIONE

11) OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO BOTANICA:

COLORAZIONE SARAFINA- FAST GREEN DI

9) SPARAFFINATURA SEZIONI SOTTILI DI FUSTO DI MICRO TALEE DI PINO E CARRUBO

1) PRELIEVO

INCLUSI IN PARAFFINA

5) INCLUSIONE:

• infiltrazione
• indurimento

7) RACCOLTA SEZIONI SUL

6) SEZIONAMENTO AL

VETRINO PORTAOGGETTO MICROTOMO

8) COLORAZIONE

LA COLORAZIONE CON BLU DI TOLUIDINA E' UN PROCESSO

METACROMATICO

OCCORRENTE:

• materiale vegetale fresco
• lamette

di sicurezza/bisturi- supporto per il tglio- midollo di sambuco- vetrini da orolofgio per colorazione- H2O distillat- colorante: blu di toluidina soluzione 0,05% in H2O- vetrino porta-oggetto- vetrino copri-oggetto- carta assorbente

L'OSSERVAZIONE AVVIENE i colorantii vitali possono essere:- al microscopio ottico -neutri-stereo microscopioVANTAGGI -basiciBOTANICA - microscopio inveertito o a contrasto di fase- PIU' VISUALIZZAZIONE IMMEDIATA DEL CAMIONE -acidiPUO AVVENIRE GRAZIE A.1- ESAME A FRESCO DI SEZIONI A MANO SVANTAGGI - autoflorescenza del campione nel microcopio a fluorescenza- DEFORAZIONE DEL CAMPPIONE DOPO I TAGLIO - grazie ai fluorocromi- scarsa sottiglieza delle sezioni - ai vitali

OSSERVAZIONE A FRESCO:Asparago: monocotiledonestruttiura primariaSedano: dicotiledonestruttura secondaria, dotti secretoricolorazione con blu di toluidina

ISTRUZIONI PER LA COSTRUZIONE DELLA CHIAVE1) ANALIZZARE GLI ESEMPLARI DELLA MIRMECO FAUNANOME DELLA SPECIE, AUTORE E ANNO, RANGE

Caratteristiche della dimensione della formica

Osservando le immagini, è possibile individuare le seguenti caratteristiche:

1. Mandibola
2. Ocelli
3. Propodeo
4. Spine
5. Postpeziolo

Principio di esclusione

Il principio di esclusione è un metodo utilizzato per identificare le formiche in base a caratteri diagnostici. Le categorie individuate possono essere suddivise in gruppi.

Caratteristiche generali e individuali

Le formiche presentano caratteristiche generali comuni, ma anche caratteristiche individuali come il polimorfismo.

Costruzione di una chiave dicotomica

La chiave dicotomica è un metodo utilizzato per identificare le formiche attraverso una serie di domande a cui è possibile rispondere con "sì" o "no". È importante cercare caratteristiche ridondanti per garantire la validità della chiave.

Creazione e completamento della chiave dicotomica

È necessario creare una chiave dicotomica completa e testarne la validità. Eventuali errori devono essere corretti.

Riferimenti per la costruzione della chiave

Per la costruzione della chiave dicotomica, si possono fare riferimento alle seguenti caratteristiche:

• Mandibola
• Ocelli
• Propodeo
• Spine
• Postpeziolo

Sistema per misurare il tasso di decomposizione

Esistono due metodi per misurare il tasso di decomposizione: il metodo tradizionale utilizzando sacchetti di lettiera e il metodo moderno utilizzando bustine di tè verde e Rooibos e tè rosso africano Lipton.

Materiale necessario

Per il sotterramento, è necessario disporre del seguente materiale:

• Bustine di tè verde
• Pesa
• Paletta
• Metro
• Tabella con dati da inserire (nome, cognome, N sito, data inizio e fine, N° busta, etichetta, cordino, note)

STUFA PER ESSICCARE IL TE' RECUPERATO (70°C PER 48 h) MATERIALE , METODI, ANALISI DATI ESPERIMENTO DI LABORATORIO DEGLI TASSO DI DECOMPOSIZIONE, FATTORI CHE LO INFLUENZANO: IL TASSO DI DECOMPOSIZIONE PUO' ESSERE CORRELATO ALSTUDENTI : 2019 E 2020 -condizioni ambientali CAMBIAMENTO CLIMATICO:ECOLOGIA: SE C'E' UN ALTO TASSO DI DECOMPOSIZIONE MA LE PIANTE NON-proprietà chimiche della sostanza organica mortaDECOMPOSIZIONE CONVERTO LA CO2 IN CARBOIDRATI E OSSIGENO SI-tipo di decompositori presenti nel suolo HA AUMENTO DI CO2-presenza di contaminantiORGANIZZAZIONE PER LA RACCOLTA DI DATI ECOLOGICI:Citize scienceMETODO:- mettere il codice identificativo sulla busta di tè verde- effettuare il peso lordo e netto del tè: con busta e senza busta- posizionare le tre buste per studente in sito a 8 cm sotto il suoloANALISI DATI:ML e FMR2019: stella azzurra in grafico- studenti distribuiti soprattutto nel n