Tecniche di lab. integrate Defilippi

Tecniche di colture cellulari

Importanza dell'adesione cellulare nella proliferazione

Colture cellulari: stabilire e mantenere linee cellulari in vitro derivate dalla disaggregazione di tessuti o isolate da fluidi biologici come il sangue (es. per i linfociti).

Origine del materiale

Tessuti embrionali: es. fibroblasti o neuroni embrionali da animali di esperimento.

Tessuti adulti: es. endotelio da cordone ombelicale, spermatogoni da testicoli. Tramite biopsie. Il cordone ombelicale contiene al suo interno delle cellule staminali; c'è anche dell'endotelio. Gli spermatogoni hanno un vantaggio: possono essere ri-differenziati e ri-propagati in modo continuo.

CS totipotenti generano qualsiasi tipo di cellula e anche le cellule di placente e cordone ombelicale. → pluripotenti Blastocisti (inner cell mass); possono generare tutte le cellule tranne i tessuti extra-embrionali. → tessuti → nicchie

Embrione e adulto in via di differenziamento di cellule staminali multipotenti (sono già specificate per un determinato tessuto). In Italia, non si possono effettuare studi dalla blastocisti in poi.

La maggior parte dei tessuti umani presenti nei laboratori è di origine patologica (es. cellule tumorali). Per studiare la situazione fisiologica si è passati ai modelli animali. Fibroblasti da tessuti embrionali: cellule mesenchimali.

Vantaggi e svantaggi delle colture cellulari

Sistema semplificato e riproducibile; tuttavia così manca l'integrazione con il resto dell'organismo. Si può sopperire a questo svantaggio tramite le co-colture (un tipo cellulare sostiene l'altro).

La coltura consente l'analisi dei meccanismi cellulari e molecolari in maniera semplice (c'è un controllo ambientale a monte); svantaggi: le concentrazioni dei reagenti non sono quelle presenti in vivo + c'è difficoltà nel correlare le concentrazioni in vivo con quelle in vitro. In vivo per esempio ho dei gradienti.

Usando l'animale, svantaggio è il suo costo e la risposta "lenta". Vantaggio con le cellule: risposta rapida, economicità. Vantaggio: disponibilità di linee cellulari e ragioni etiche (presenti invece usando gli animali).

Campi di interesse delle colture cellulari

Le colture cellulari interessano: biologia cellulare, molecolare, genetica e citogenetica, virologia, farmacologia, immunologia, oncologia…

Le colture cellulari possono avere vari scopi:

• Cellule coltivate in vitro possono fungere da materiale di partenza per l'estrazione e caratterizzazione di acidi nucleici o proteine;
• Usate per studi funzionali o di regolazione;
• Per rigenerare in vitro tessuti danneggiati da traumi: medicina rigenerativa (es. epidermide viene coltivata);
• Per terapia genica di patologie (rigenerare in vitro tessuti o organi nel caso di patologie genetiche e/o tumorali: trapianti autologhi).

Dalle mesenchimali staminali posso ottenere osso, cartilagine, tessuto adiposo ma anche neuroni.

Un campione di tessuto contiene 4-5 tipi cellulari. Se metto in coltura, ottengo un misto di cellule. Dovrò quindi disgregare il tessuto se voglio un solo tipo cellulare. Un tipo cellulare prenderà il sopravvento se non separo i vari tipi cellulari. I fibroblasti sono facili da coltivare. Devo disgregare per separare i vari tipi cellulare. Lo faccio con un omogenizzatore e per digestione enzimatica con enzimi proteolitici (nel citoplasma trovo soprattutto collageni). Uso quindi delle collagenasi. Posso usare anche tripsina ed EDTA. Caderine sono attive se ci sono ioni Ca²⁺, se metto l'EDTA che lega il Ca, stacco le interazioni. La tripsina è un enzima proteolitico generico, taglia tutte le proteine esposte sulla matrice esterna (caderine, integrine) → le cellule si staccano. Tutto viene fatto a 37°.

Ottengo una sospensione cellulare con più tipi cellulari → è una coltura primaria mista.

Dynabeads: separatore biomagnetico. La cellula ha all'esterno delle proteine che sono marcatori di specificità. Uso questi marcatori per selezionare le cellule → uso degli anticorpi purificati per selezionare questi marcatori. L'anticorpo riconosce un epitopo (un pezzo di proteina molto specifico, anche 3-4 AA) di una proteina specifica. Se ho l'anticorpo lo lego a delle biglie che possono essere magnetiche → recuperabili in un campo magnetico. Mischio queste biglie con l'anticorpo alle cellule. Se queste cellule hanno l'epitopo, la cellula si ancora alla biglia → passo il magnete, tiro giù le biglie con le cellule. Separo poi con un tampone le biglie dalle cellule. Il 99% delle cellule sono quelle che voglio.

Per isolare una particolare preparazione uso:

• Marcatori di superficie; è un sistema più costoso perché devo avere dei reagenti che devo comprare; gli anticorpi possono essere recuperati.
• Guardo le cellule al microscopio e le distinguo sulla base di caratteristiche fenotipiche. Devo lavorare però a basse diluizioni.

Vantaggio delle cellule circolanti: non aderiscono a nessuna matrice. CD sono marcatori di superficie specifici di linfociti circolanti.

Citofluorimetro a flusso (cell sorter): usa un raggio laser e un anticorpo reso fluorescente. C'è quindi un cromoforo eccitato dal laser e che emette ad una certa lunghezza d'onda. Al posto della biglia ho quindi il fluoroforo. Lo strumento separa le cellule in base al loro colore (marcate + da quelle non marcate). Quelle marcate finiscono all'interno di un collettore. Difetto dell'apparecchio: le cellule devono passare singole, altrimenti non vengono riconosciute. Alcune cellule positive si perdono. Svantaggio: apparecchio molto costoso, molto delicato.

Colture primarie e linee cellulari continue

Le colture primarie (derivanti direttamente da un tessuto) hanno un n° definito di divisioni in vitro, dopo degenerano (per apoptosi, senescenza). Questo perché hanno già un loro destino, sono già differenziate. La coltura deve quindi essere continuamente ripreparata. Il n° di passaggi dipende anche dall'età del tessuto. Una soluzione potrebbe essere la riprogrammazione. Le cellule che fanno parte di tessuti solidi crescono in vitro "mimando" il tessuto di adesione → piastra di adesione. Ad un certo punto possono verificarsi delle mutazioni spontanee. Volendo le posso indurre e annullare il programma genetico della senescenza, ottenendo una linea cellulare continua. Questa linea non andrà più incontro a senescenza → linea cellulare immortale. Es. cellule HeLa (Henrietta Lacks che aveva avuto un tumore → linea epiteliale ancora usata).

3T3: fibroblasti murini. COS: derivate da rene di sciammia. CHO: dall'ovaio della cavia. Sono le uniche cellule usate nell'industria per la produzione di farmaci ricombinanti; non sono umane e quindi non possono essere infettate da virus umani. PC12: mima il neurone (dal ratto). Deposito internazionale di cellule: ATCC. Qui vengono depositate tutte le linee cellulari disponibili e si possono comprare.

Piastre da coltura

Sono disponibili piastre per colture cellulari e piastre per batteriologia (queste utilizzabili anche per la coltura di cellule in sospensione). La plastica è diversa. Sono tutte in polistirene, ma la superficie di quelle da coltura è trattata chimicamente in modo da renderla idrofila e carica negativamente: il polistirene è così capace di legare i fattori di adesione presenti nel siero.

Per poter proliferare, le cellule richiedono 3 principali fattori:

• Fattori di crescita
• Metaboliti e nutrienti
• Ancoraggio al substrato

Terreno di coltura

Terreno di coltura: soluzione acquosa che contiene gli elementi nutritivi di base per la sopravvivenza e proliferazione. Elementi nutritivi di base: glucosio, aa, sali minerali, vitamine (contenuti nel terreno di coltura). I terreni si differenziano per la diversa concentrazione di glucosio, di aa e di sali minerali. → MEM = minimal essential medium contiene il minimo dei fattori essenziale.

Siero bovino fetale è il più usato. Il siero serve a fornire tutti i fattori di crescita necessari per la proliferazione/differenziamento cellulare. Sono di natura lipidica (ormoni) o proteica. Favoriscono l'ingresso nel ciclo cellulare. Il siero condiziona il tipo di coltura cellulare. Il siero contiene anche i fattori di adesione; sono proteine contenute nel siero. Il più importante è la vitronectina che lega le integrine.

Se le cellule non si attaccano o mancano questi fattori o le cellule sono in condizione di quasi morte cellulare. Nelle coltura primarie, i fattori di crescita forniti dal siero possono non essere sufficienti. Le cellule epiteliali hanno bisogno anche dell'EGF per esempio.

Le cellule crescono con un pH ristretto. Range di pH ottimale: 7.2-7.4

Bisogna quindi controllare lo scambio gassoso. Le piastre Petri sono fatte in modo da permettere questo scambio. Nelle fiasche il tappo non è mai avvitato fino in fondo. Per lavorare a 37°, abbiamo bisogno di un termostato che deve avere un sistema che crea umidità all'interno dell'incubatore. Deve esserci anche un sistema gassoso che mantiene 5% di CO₂ all'interno dell'incubatore. Questo serve per il mantenimento del pH. Il tampone si mette in equilibrio con la CO₂ dell'ambiente. Il tampone è formato da NaHCO₃ che nel terreno si dissocia in HCO₃- + Na⁺.

→ CO₂ + HCO₃- + OH- così però tendo ad andare verso il basico. Se c'è la CO₂ nell'incubatore però la reazione si sposta indietro e si tende ad avere la reazione opposta. Nel terreno di coltura c'è un colorante: rosso fenolo. Questo è un marcatore di pH. Diventa arancione quando il pH scende; diventa viola quando il pH sale (7-8). Se è diventato giallo vuol dire che le cellule hanno proliferato molto = hanno consumato molti nutrienti. Viola: le cellule stanno morendo.

Cellula a confluenza: le cellule sono cresciute all'interno della piastra e l'hanno riempita. Arrivate a questo stato le cellule non proliferano più perché hanno l'inibizione da contatto. Devo quindi passare le cellule = staccarle da questa matrice e diluirle in modo che ridiventino singole.

Si usa l'EDTA per chelare il Ca e la tripsina per staccare le cellule l'una dall'altra. Bisogna controllare di aver recuperato tutta la popolazione cellulare. La tripsina deve essere neutralizzata e ciò viene fatto dal siero. Semino in nuove piastre con il fattore di diluizione. Questo fattore è variabile a seconda delle cellule. → soluzioni

Alcune cellule devono "sentirsi" l'una con l'altra, molto diluite le cellule potrebbero non crescere più. Tempo di duplicazione: 20-30 h. Devo staccarle bene per evitare di selezionare sottotipi di cellule. 1 Le integrine sono presenti in tutte le cellule

Bisogna contare le cellule. Distribuirle in modo omogeneo.

Camera di Burker: vetri incisi con delle griglie su cui si contano le cellule.

Sterilità

Bisogna prevenire la contaminazione delle colture. I terreni e le soluzioni sono sterili; se preparati, si sterilizzano per filtrazione. Si aggiungono antibiotici: penicillina e streptomicina. Tutto viene fatto sotto cappe a flusso laminare.

Conservazione delle cellule

Sono conservate in azoto liquido a -196°C. Raggiunta questa temperatura di stock, possono rimanere anche per anni. Per essere sicuri che tutte le reazioni enzimatiche siano bloccate, bisogna scendere ad almeno -130°. A -196° mantengono lo stato di quiescenza. Tuttavia, bisogno aggiungere un agente crioprotettivo (DMSO) che evita che l'acqua congeli formando dei cristalli. Si romperebbe la cellula. Lo scongelamento deve essere molto rapido; si mettono subito a 37°; si attaccano e proliferano.

Linee di cellule tumorali e ibridomi per produzione di anticorpi monoclonali

È più facile tenere in coltura le cellule tumorali. Quelle normali hanno cicli di riproduzione più lunghi e vanno più facilmente in senescenza. Le tumorali sono già trasformate; hanno mutazioni spontanee o indotte. Le tumorali esprimono degli oncogeni. → crescono Le linee trasformate però non hanno più inibizione da contatto a mucchietti. [HeLaS crescono in sospensione]

Colture tridimensionali di cellule normali e trasformate

Quando passo da 2D a 3D devo sfruttare la capacità delle cellule di essere adagiate su una matrice che però deve essere qui più complessa. Le cellule di per sé producono la propria matrice. Usiamo proteine della matrice come scaffold = creo una rete di maglie dentro cui le cellule vengono immerse. Collagene I: proteina della matrice filamentosa che forma una rete al cui interno si disseminano le cellule. Si ricava dai tendini di animali da esperimento. Portato ad un determinato pH, il collagene forma una struttura 3D.

Matrigel: mistura complessa di proteine della matrice che derivano da un modello animale (topo EHS che ha → iperproduzione un sarcoma di proteine della matrice). Dentro a questi cuscinetti di matrice vengono adagiate le cellule. Essendo gelatinoso, ha una tendenza a cambiare consistenza a seconda della temperatura. Si mantiene congelato e poi si porta a temperatura ambiente; a 20° è ancora gelatinosa; si prende e si mette nelle piastre di coltura; qui forma delle maglie lasse. È il modo che riproduce meglio la matrice cellulare dei nostri tessuti.

Laminina: proteina extracellulare tipica delle cellule epiteliali. Coltura 2.5 D: sotto viene inserito un cuscinetto di matrigel. Se aspettiamo alcuni giorni, si sviluppano strutture che sono ad acini (somigliano molto agli alveoli della ghiandola mammaria). Usata per le cellule MCF-10A: ricavate da linee epiteliali di cellule normali; non vanno più in senescenza; quando le piastriamo dentro o sopra la matrice, danno origine ad una pallina = aggregato di cellule che ha uno spazio esterno. La matrice sottostante polarizza le cellule → le cellule capiscono interno/esterno. Ad un certo punto si svuota la camera interna, tramite morte cellulare. Il contatto con la matrice dà un segnale di sopravvivenza. Si ottiene quindi una cavità e le cellule diventano capaci di secernere proteine del latte.

Si possono far crescere le cellule direttamente dentro matrigel. Se usiamo cellule staminali o primarie mai messe in coltura prima, possiamo ottenere degli organoidi. Questi riproducono la struttura dell'acino ma anche i dotti. Per questo bisogna mescolare matrigel e collagene (1:1).

Ci deve essere sempre un'interfaccia con l'ossigeno. Fettina di cervello messa a contatto con una membrana al di sotto di cui si trova un terreno adatto al mantenimento della fettina: coltura organo-tipica (espianto d'organo). Si mantengono per qualche giorno e mantengono al struttura 3D dell'organo. Se facciamo avvenire EMT (si somministra TGF-β), all'interno di una matrice, si può vedere il cambiamento della cellula che diventa mesenchimale e tende a scappare via.

Produzione degli ibridomi

Usata per la produzione di anticorpi monoclonali contro uno specifico antigene. Sistema policlonale di anticorpi: siamo policlonali per gli antigeni che abbiamo incontrato finora. A scopo di ricerca però serve avere un anticorpo monoclonale. Ne selezioniamo uno solo tra la classe dei policlonali, quello più efficace a riconoscere l'antigene. L'anticorpo monoclonale è puro (prodotto da un unico linfocita B); produce immunoglobuline specifiche per l'antigene e unico per quell'epitopo.

Ho l'animale da esperimento; lo immunizzo con l'antigene X; il topo reagisce come noi quando veniamo vaccinati; il topo produce gli anticorpi che riconoscono la proteina X. Sono linfociti B del topo; questi possono essere purificati e sono cellule differenziate. Se li mettiamo in coltura, i linfociti B del topo muoiono.

Uso quindi una linea mutante derivata da un tumore ematologico: mieloma. Questo mieloma produce in modo continuo il linfocita B perché l'hanno immortalizzato.

Per la produzione dell'ibridoma ricorriamo quindi alla produzione di cellule ibride. Fonda le due cellule usando un agente di fusione che permeabilizza le membrane cellulari; quando due cellule sono vicine si fondono. Avremo quindi cellule con due nuclei: eterocarionti.

Prendo i linfociti B dalla milza del topo che hanno la condizione policlonale. Le cellule del mieloma che non si sono fuse possono sopravvivere. Queste vengono selettivamente uccise con un terreno selettivo che permette di dare importanza ai linfociti B. Ad un certo punto crescono solo gli ibridi che complementano il mieloma con il linfocita B. Solo le cellule ibride che produrranno però tutti gli anticorpi. Avremmo quindi una produzione policlonale. Prendo la miscela e faccio crescere una a una le cellule in pozzetti separati. Ognuna produce un singolo anticorpo. Verifico poi qual è l'anticorpo che mi interessa. Separo poi quel pool di cellule che mi interessa (clone) e questi anticorpi saranno anticorpi monoclonali.

HGPRT+: via che dalla ipoxantina riesce a sintetizzare nucleotidi. L'aminopterina impedisce questa via. Sono vie biochimiche di salvataggio. Le cellule di topo sono HGPRT+; producono il clone di immunoglobuline che ci interessano e sono mortali. La linea del mieloma invece è immortale; non produce immunoglobuline; è HGPRT-. Il mieloma cresce normalmente perché sfrutta la linea de novo. Se però diamo aminopterina queste muoiono. È il trucco per poter separare gli eterocarionti che ci interessano. Agente di fusione è il glicole-poli-etilenico. Di tutti gli eterocarionti, ce ne interessa solo uno. Il mezzo di selezione contiene l'aminopterina (blocca la proliferazione del mieloma) e fornisce timina e ipoxantina.