Tecniche di lab. integrate Defilippi

19 OTTOBRE ANALISI PROTEICA IN VITRO

Alcune proteine endogene sono tessuto-specifiche (espresse solo in determinate condizioni), altre sono

costitutive (es. actina, enzimi della glicolisi). 

Le proteine del differenziamento sono tessuto specifiche es. proteine dei filamenti intermedi che sono:



in cell epiteliali cheratine. Se trovo cheratina in una cell, posso dire che è una cell epiteliale.



In cellule mesenchimali vimentina (es. fibroblasti del tess. connettivo);



In cellule muscolari desmina.

 

In neuroni neurofilamenti (nestina) strutture filamentose.

Posso usarle come marcatori per individuare il tessuto di appartenenza.

Le molecole sono molecole fragili; hanno una loro struttura. La loro forma è quasi sempre connessa

all’attività.

Tutto si mantiene in un ambito ristretto di pH (7-7.1) e temperatura (37° nei mammiferi superiori).

Per studiarle devo estrarle dal loro contesto e purificarle per caratterizzarle.

 Estrazione

 Purificazione

 Identificazione: quali proteine sono presenti in un determinato contesto cellulare.

 Determinazione quantitativa: ordine delle femto/picomoli. Determino sia un controllo (livello basale) che

l’esperimento. Posso aumentare/diminuire la produzione di proteina basale agendo a livello trascrizionale

(miRNA) e post traduzionale.

 Determinazione qualitativa (modificazioni post-traduzionali, es. fosforilazione su Ser, Thr, Tyr, o

acetilazione….).

 Determinazione funzionale (attivazione): ho una certa quantità di proteina. Se cambia la sua espressione

saggi

(in positivo o in negativo), durante un evento sperimentale, mi chiedo qual è la sua funzione.

funzionali in vitro, oppure si ritorno agli esprimenti in vivo per vedere la funzione all’interno della cell.

L’attivazione riguarda tutti gli enzimi che necessitano della presenza del substrato per essere attivati.

Estrazione e poi purificazione non devono cambiare il livello di espressione e/o le modificazione post-

traduzionali, né l’attività della proteina.

Partiamo da un mix di proteine. Decido quindi di identificare un certo numero (relativamente piccolo) di

proteine. Da questi esperimenti posso tratte delle ipotesi. Troviamo un’enorme letteratura che definiscono il

ruolo e la funzione della proteina nel tessuto.

Metodi di separazione

Si separano in base a caratteristiche fisico-chimiche:

Grandezza: le dimensioni si ricavano da PubMed per es.

- Carica: dall’analisi degli aa che compongono le proteine, posso ricavare il punto isoelettrico = punto in cui

- cariche + e – si equivalgono all’interno di un range di pH. L'aggiunta del gruppo fosfato, cambia l'attività

delle proteine, poiché aggiungo una carica +.

Solubilità;

- Stabilità al calore;

- Capacità di assorbimento da parte di determinate matrici.

-

Cromatografia: si purificano dei picchi che migrano dando un’idea delle dimensioni della proteina.

Devo sapere il motivo del tipo di purificazione; devo sapere da quale materiale parto e quanto ne voglio. 21

Ho due tipi di purificazione:

analitico: parto da un campione piccolo (che diventa sempre più piccolo man mano che le tecniche si

- affinano) il che riduce costi e lavoro. Identifico la proteina e determino delle caratteristiche.

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Preparativo : ad esempio per la produzione di enorme quantità di proteine ricombinanti. Parto da grosse

- quantità che separo con la cromatografia.

Purezza: nel preparativo deve essere estrema (> 98% nei cataloghi).

Large-scale: sistemi industriali per la produzione di proteine ricombinanti che permettono di isolare grandi

quantità della proteina che ci interessa.

Small-scale methods: sono più usati per il sistema analitica. Spendo meno e comunque in molti metodi

ottengo poche proteine. 

Quando separo una proteina da un contesto cellulare, cambio comunque le sue proprietà fisico-chimiche

esco dal concetto di proteina nativa. Devo verificare che le condizioni strutturali siano mantenute se devo fare

dei saggi, altrimenti non potrò mai avere nessuna attività.

La determinazione quantitativa e preparativa si può fare su proteine denaturate.

La determinazione funzionale richiede invece la proteina nativa, che ha mantenuto la sua conformazione.

Le proteine, nelle cells, raramente funzionano da sole ma hanno dei partner. Esistono complessi proteici che si

regolano l’uno con l’altro. Metodi basati sulla solubilità proteica

Normalmente le proteine interagiscono con la soluzione acquosa cellulare. La sua solubilità dipende

soprattutto dalla seq. in aa, in base a cui possiamo determinare la taglia, la forma (tramite dei software),

idrofobicità e cariche elettriche.

Proteine che hanno segmenti idrofobici: pezzo di proteina che è un’α elica precisa che non è in grado di

formare ponti H.

Es. glicoforina: proteina di membrana che ha un pezzo che sta fuori glicosilato e uno che sta dentro che può

stabilire legami H. La membrana fa da barriera perché il doppio strato lipidico è impermeabile alle soluzioni

acquose.

Una prot. che sta sempre dentro al citoplasma non avrà componenti idrofobiche maggiori (o ce le ha in un

nucleo interno).

L’α elica idrofobiche è caratteristica delle prot. di membrana.

Tramite plot idrofobico determino se si tratta di una proteina di membrana oppure no (non ha domini

idrofobici).

A seconda della prot. che voglio studiare, dovrò usare solubilizzanti diversi. 

Se devo solubilizzare prot. citosoliche o nucleari, so che non avranno segmenti idrofobici posso usare un

certo tipo di tecnica. Se hanno segmenti idrofobici ne devo tenere conto.

Per solubilizzare le prot., posso cambiare il pH, la forza ionica, la temperatura.

Cambiare il pH o la forza ionica vuol dire alterare l’eq. isotonico di una cell. Se cambio la forza ionica, prendo



le cells e le metto in un tampone che ha un contenuto di ioni diverso dalla condizione isotonica rompo la

membrana e lascio che esca il contenuto intracel.

Se faccio una soluzione che contiene meno sali (da 150 mM passo a 50 mM), faccio entrare tanta acqua nelle

cells (questo in una soluzione ipotonica). Isolo così le membrana dalla parte citosolica.

9 LARGE-SCALE 22



Se voglio studiare componenti citoplasmatiche, posso cambiare il tampone, portarlo ad essere ipotoniche

rompo le cells e recupero quello che c’è in soluzione.

Lavorare sulla forza ionica è più semplice.

Usando cariche elettriche, posso spaccare la cellula (regola la durata se voglio la cell viva).

Nella maggior parte dei casi voglio una precipitazione selettiva.

Avrò interazioni proteina-solvente (che tendono a mantenere in soluzione le proteine), proteina-proteina

(permettono aggregazione).

Salendo di forza ionica (soluz. ipertonica), oltre a spaccare la cellula, tendo a far precipitare le proteine dentro

le cellule.

Cells di mieloma (usate per la produz. di Ab monoclonali) sono piene di IgG che vengono rilasciate dalle cells.



Posso avere una fiasca di coltura in cui ho le cells che hanno prodotte IgG scarto le cells e guardo solo le



IgG che ho nel terreno di coltura. Devo estrarle dal terreno (10 mg/ml) uso il solfato di ammonio che è un

  

sale le prot. più concentrate tendono ad aggregare cambia la forza ionica le prot. cambiano struttura

ma si aggregano e precipitano fuori (salting out).

 

Ottengo un pellet proteico posso risolubilizzarlo, riportarlo ad un pH e forza ionica normale forma nativa

delle prot. 

Il solfato di ammonio (NH ) SO è molto solubile in acqua l’acqua si lega tutta al solfato e si stacca dalle

4 2 4

proteine che escono dalla soluzione.

Per “indurre” disidratazione si usa anche NaCl.

Ogni volta che voglio fare una separazione di proteine devo comunque frazionare i

componenti per centrifugazione. Dentro le cells ho tantissimi compartimenti;

ognuno di questi ha prot. particolari. Devo quindi avere centrifugazioni differenziali.

 

Se voglio rompere la cell, uso i metodi visti prima avrò una soluz. che contiene

devo fare centrifugazioni differenziali per liberarmi di queste membrane ed avere il

contenuto proteico che mi interessa.

Centrifugazioni differenziali:

800g pellet di nuclei Centrifughe normali

12.000g pellet di mitocondri, lisosomi e microcorpi



Pochi giri sedimentano le cose più pesanti

50.000g pellet di microsomi (fraz.di membrana) Ultracentrifughe (cambio

300.000g ribosomi liberi apparecchio). Raggiungono

queste velocità sotto-vuoto.

Surnatante: fase solubile (la parte non precipitata).

Ogni volta seleziono il pellet e ricentrifugo. 23

20 OTTOBRE

Nella maggior parte dei casi si usano dei detergenti che permettono di estrarre le prot. di membrana.

La possibilità di estrarre le proteine da tutti i compartimenti è

garantita dall’utilizzo dei detergenti che spiazzano i lipidi.

I detergenti formano delle micelle che si sostituiscono ai lipidi. Così

le proteine sono all'interno di una micella di detergente. Il

detergente ha una testa idrofila, e quindi la micella (con dentro la

proteina) sarà solubile nel tampone acquoso.

Vari tipi di detergenti:

 SDS: sodio dodecil solfato. È un acido grasso, quindi ha tutte le

caratteristiche per potersi inserire nello strato lipidico. Ha un SO 3



con carica negativa detergente ionico. Grazie alla sua carica

può cambiare la carica proteica. L’SDS denatura le prot.

togliendo la loro carica intrinseca e rendendole cariche

negativamente. Perdono così il loro pI.

 CHAPS: ha la natura di uno steroide e può così competere con i lipidi di membrana. Ha anche un terminale

SO - analogo a quello dell’SDS.

3

 octyl-β-glucoside e Triton: hanno una componente lipidica ma non hanno cariche. Sono detergenti non-

ionici o a bassa forza ionica. Sono efficaci nel solubilizzare le prot. di membrana ma non alterano la loro



struttura la prot. resta “nativa” con la sua carica intrinseca e la sua struttura 3D.

Triton non ha effetto dirompente per il mantenimento delle caratteristiche native delle proteine.



Se ho un complesso proteico di membrana, posso usare un agente denaturante (es. SDS) denaturazione



della proteina (carica proteica negativa) micella lipidica con detergente che mi da una grande resa, ma mi

da proteine denaturate.

Detergente non denaturante (es. Triton, CAHPS): la carica di questi detergenti è meno forte di quella dell’SDS

la proteina non si è denaturata.

Dopo l'estrazione con Triton, otterrò una proteina nativa sulla quale posso effettuare saggi di attività

biologica.

Triton e NP-40 sono simili.

Se effettuo estrazione con SDS otterr&og