Tecniche Di Biologia Molecolare Recchia

INFEZIONE MEDIATA DA VIRUS

Le cellule possono anche essere infettate mediante l’utilizzo dei virus:

Di solito, quando si infettano le cellule con un virus il 70% delle cellule sono positive

◊ (dopodiché si procede con il clonaggio per diluizione limite, che risulta efficiente).

Nel caso dei virus, si parla di cellule infettate e non di trasfezione (come per i plasmidi).

Nella trasfezione si usano i plasmidi.

Quindi:

L’efficienza aumenta con l’uso di virus (del 70-80%) e per separare e clonare le cellule si procede

attraverso diluzione limite, che risulterà efficiente perché la maggior parte delle cellule infettate

saranno positive.

L’infezione mediata da virus viene utilizzata per veicolare DNA esogeno all’interno di una cellula;

vi sono virus che integrano (si parla di infezione stabile) e virus che non integrano il loro genoma

nel genoma della cellula infettata (in questo caso si ha l’equivalente della trasfezione transiente).

I virus possono essere:

Retrovirus: essi infettano cellule in divisione e si integrano stabilmente nel genoma

1) Lentivirus: possono infettare cellule che non replicano (cioè cellule quiescenti) e cellule in

2) divisione

Adenovirus: non si integrano nel genoma

3) Virus adeno-associati (AAV): possono integrare in una regione sito-specifica del cromosoma

4) umano (regione del cromosoma 19) oppure rimanere in forma extracromosomiale (in forma

stabile nel tempo). 28

ADENOVIRUS

sono virus a dsDNA (30-38kb), non si integrano nel genoma, perciò il prodotto

che veicolano viene perso durante le divisioni cellulari; essi sono usati per

vaccini e vettori oncolitici per tumori solidi esterni.

Vi sono tanti sottogruppi e sierotipi di adenovirus.

Essi vengono utilizzati principalmente per le cellule in divisione.

Come entrano gli adenovirus nelle cellule?

Entrano nella cellula mediante il riconoscimento di un recettore della cellula in divisione (il CAR

receptor) posto sulla membrana della cellula.

Il CAR receptor è coadiuvato alle integrine. Il virione entra in

vescicole endocitotiche (o endosomi); quando l’endosoma

matura e diventa più acido, il virus subisce passaggi di perdita

del rivestimento, che a poco a poco rimuovono le proteine

strutturali del capside. Una delle proteine rilasciate dal

capside lisa la membrana degli endosomi, rilasciando ciò che

resta del virus nel citosol. Ciò che rimane del virus, si lega ai

microtubili e grazie all’interazione con la dineina, il virione

raggiunge il nucleo della cellula rilasciando il DNA al suo

interno (all’interno del nucleo della cellula infettata).

Il DNA virale diviene vettore quando noi vi inseriamo

(cloniamo) il nostro cDNA di interesse.

Per modificare il genoma virale possiamo rimuovere la regione E1 (early genes, oncogeni) e

sostituirla con il cDNA, che si può incapsidare solo se la sua size è compresa tra 75-105%.

[Si può clonare al posto del gene E1 il gene di interesse, che può essere un gene terapeutico].

In questi virus, i siti ITR (inverted terminal repeat = sequenze terminali invertite) fungono da siti

cos.

I vettori in cui dell’adenovirus wild-type sono rimasti solo i siti ITR e il sito di packaging, possono

trasportare fino a 28-30kb inserendo un’expression box (o cassetta di espressione).

Se il cDNA è minore di 28-30kb riempiamo i gaps con DNA stuffer (ossia non coding e non

ripetitivo).

[Si possono eliminare anche i geni E2 e E4, che sono geni precoci del ciclo vitale dell’adenovirus].

[I vettori advantages sono quei vettori in cui dell’adenovirus sono rimaste le ITR e le sequenze di

packaging (ψ)].

DNA stuffer = DNA non codificante e non ripetitivo (è meglio utilizzare come DNA stuffer del DNA

umano poiché noi utilizziamo cellule umane).

La cassetta di espressione contiene:

Promotore

◊ c-DNA

◊ segnali di poliadenilazione

◊

Posso sostituire una regione genomica del virus

oppure tutto il genoma virale (mantenendo le ITR

e le sequenze di packaging) e per fare ciò, devo

clonare 28-30Kb di cassetta di espressione.

Quando il DNA viene incapsidato nel virione, si

infettano le cellule umane si ha l’entrata del 29

virione, che rilascia il DNA modificato nel nucleo della cellula infettata (con espressione transiente

del gene di interesse).

AAV (VIRUS ADENO-ASSOCIATI)

Questi virus sono più piccoli rispetto agli adenovirus

◊ Sono in grado di infettare cellule in divisione e cellule non in divisione

◊ Sono selettivi per l’uomo e per le scimmie

◊ Il vettore adeno-associato non wilde type non rimane integrato nel genoma della cellula ospite.,

◊ perciò si ha un’espressione transiente

Questi virus possono integrarsi in una regione sito-specifica del cromosoma 19 (frequenza 1%), ma

possono rimanere stabili nel tempo in forma extracromosomale.

Infettano sia cellule proliferanti sia cellule quiescenti, sono ssDNA virus.

Il vettore AAV perde la specificità per il cromosoma, pertanto non si integra e porta ad una

espressione transiente.

Il genoma dei virus AAV contiene le sequenze ITR, i segnali di packaging e due ORF (2 operining

frame, cioè 2 geni) che utilizzano lo splicing alternativo: questi geni sono chiamati CAP (codifica il

capside) e REP (replicazione e inserzione sito-specifica).

CAP = codifica per 3 prodotti proteici, cioè per le proteine del capside (grazie allo splicing

alternativo)

REP = codifica proteine importanti per la replicazione e l’inserzione sito-specifica (del genoma)

del virus AAV

[Le ITR sono importanti per la replicazione, integrazione e impaccamento del DNA].

Affinchè il virus AAV possa essere usato come vettore, si deve modificare il suo genoma: se devono

eliminare i geni REP e CAP l’eliminazione di questi geni permette di avere 4,6Kb a disposizione,

per l’inserimento del DNA di interesse.

[In questo spazio si devono clonare:

Promotore

◊ Segnali di poliadenilazione

◊ c-DNA].

◊

Quindi:

L’AVV ricombinato possiede solo le sequenze ITR e il sito

packaging, con 4,6kb disponibili per inserimento di un’expression

box (cassetta di espressione).

Esistono linee packaging che permettono l’impacchettamento del virus, anche se esso non possiede

più CAP e REP (queste linee packaging fanno diventare il virus privo di CAP e REP un virione

infettante), che possono effettuare sia ciclo litico che lisogeno (come il fago λ).

Di solito, però, il vettore ricombinante di espressione rimane episomale (cioè non integrato nel

genoma della cellula infettata).

Nelle cellule umane:

Integrazione random:

Il DNA ha double strands breaker, cioè rotture a doppio filamento sfalsate.

Vi sono 2 sistemi di riparo:

Ricombinazione omologa (HR): nella ricombinazione omologa lo scambio genetico avviene fra

◊ una coppia di sequenze omologhe di DNA, cioè sequenze simili o identiche. La ricombinazione

omologa ha molti usi nella cellula e l’uso più diffuso è nella riparazione accurata delle rotture

a doppio filamento. 30

Non homologous end joining (NHEJ): questo sistema, riunisce le estremità del DNA senza una

◊ regione omologa, cioè senza siti di DNA stampo.

Il vettore si può inserire nel genoma delle cellule (in queste “rotture”), attraverso il sistema di

riparazione del DNA NHEJ (non homologous end joining) che unisce gaps di DNA inserendo

nucleotidi in modo casuale, che possono generare geni knockout (di cui è stata inattivata

l’espressione); se si inserisce l’AVV, questo può integrarsi nel genoma (si ha un’integrazione

random).

[Siccome vengono inseriti dei nucleotidi in modo casuale, se l’aggiunta di questi nucleotidi avviene

dentro un esone, non si ha più il prodotto genico del gene (si ha un gene knockout)].

[Se si trasfetta nella cellula DNA con sequenze di omologia per il punto di rottura (del DNA a

doppio filamento), si favorisce la ricombinazione omologa (cioè l’inserzione del gene di

interesse)].

[NHEJE’ il meccanismo prevalente per la riparazione delle DSBs (double strand breaks),

soprattutto negli organismi con elevato numero di sequenze ripetute identiche (l’HR è un

meccanismo molto preciso, lento e dispendioso avviene in fase S/G2) è inoltre un meccanismo

rapido ed error prone (che può generare geni knockout) ed avviene in G1.

Può causare l’introduzione di errori nel codice genetico (perdita o aggiunta di nucleotidi).

La via nota è quella Ku-dipendente.

DNA-PK fosforila Ku (che ha attività elicasica, svolge il DNA favorendo l’appaiamento di regioni

di microomologia e lasciando alle estremità dei lembi a singolo filamento non appaiati) e Artemis

(che ha attività nucleasica, che rimuove le regioni a singola elica non appaiate).

Ku recluta XRCC4, che a sua volta recluta la ligasi IV che salda le due estremità a doppia elica.

L’eterodimero Ku 70/80 lega le DSBs, in tal modo protegge le estremità libere dalla degradazione,

finché la giunzione non è completa].

RETROVIRUS

Si integrano stabilmente nel genoma della cellula ospite

◊ Sono virus a RNA (mentre gli AAV sono virus a DNA a singola elica)

◊ I retrotrasposoni sono i più semplici retrovirus esistenti

◊

Essi infettano cellule in divisione e si integrano stabilmente in maniera random nel

genoma.

Sono virus a ssRNA (i retrotrasposoni sono retrovirus molto semplici) con estremità

LTR (long terminal repeat), che hanno il promotore e tre geni: pol, envelop e gag.

Dall’RNA virale si deve ottenere un dsDNA (detto provirus), in grado di integrarsi

nel genoma della cellula infettata; i retrovirus divengono vettori quando si sostituisce gag, pol e

envelop con l’expression box (“cassetta di espressione”, che contiene un promoter, il cDNA e i

segnali di polyA), mantenendo le LTR e il sito di packaging.

[Se al posto di gag, pol e env clono la mia cassetta di

espressione, ottengo un vettore di espressione].

[Studia retrotrascrizione libro di Biologia (delle superiori)].

Come ingegnerizzo il retrovirus in modo tale che contenga il mio

gene di interesse?

Prima preparo il plasmide (in tal caso devo creare tre plasmidi

di DNA) che contiene il gene di interesse: posso rimuovere tutto

dal retrovirus ad eccezione delle LTR. Anche qui c’è un limite di taglia.

Se si co-trasfettano in una cellula umana 3 plasmidi (che sono DNA): 31

un vettore con il cDNA (questo vettore è chiamato transfer

◊ vector)

uno con il gene envelop

◊ l’altro con i geni gag e pol

◊

L’unico che si impaccherà è il cDNA perché possiede le LTR e il

sito di packaging, tuttavia gli altri plasmidi sono necessari p