Tecniche Di Biologia Molecolare Recchia

Tecniche di biologia molecolare

Plasmidi

I plasmidi sono molecole circolari, che conducono una vita indipendente all'interno della cellula batterica; essi sono DNA circolari quasi sempre double strand (a doppio filamento) e sono indipendenti dal genoma batterico (cioè dal cromosoma batterico). Essi conducono una vita indipendente, perché hanno sequenze regolatorie (che si chiamano origine della replicazione), che sono necessarie affinché il plasmide replichi all'interno della cellula ospite. Di fatto, però, essi usano il "macchinario" della cellula ospite per la loro replicazione. [I plasmidi sono come dei parassiti dei batteri].

Lo spettro d'ospite di un plasmide è determinato dalla sua regione ori (ovvero dalla sua origine di replicazione). [Se un plasmide porta l'origine di replicazione per E. coli, esso può crescere solo in E. coli]. Siccome il plasmide rimane indipendente dal cromosoma del batterio ospite, chi determina la sua ripartizione nella progenie del batterio ospite (cioè, quando il batterio ospite si divide, come si dividono le copie del plasmide all'interno delle cellule figlie)?

Esistono dei geni par, che permettono la corretta distribuzione delle copie del plasmide alle cellule figlie al momento della divisione cellulare. [Questo ricorda quello che accade al centromero delle cellule eucariote, durante la divisione cellulare]. In particolare esistono 3 proteine par importanti:

• parM (actina) → questa proteina ricapitola quella che è l'actina
• parC (centromero) → questa proteina ricapitola quello che è il centromero
• parR (cinetocore) → ricapitola quello che è il cinetocore

Questo è il meccanismo che spiega, perché quando un batterio si divide, si ha sempre lo stesso numero di plasmidi in ogni cellula figlia. [Ad esempio: se un batterio ha 100 copie di un plasmide → nelle 2 cellule figlie (che si ottengono dalla divisione cellulare del batterio) vi saranno 50 copie in una cellula e 50 copie nell'altra cellula figlia].

parR lega le due regioni parC e questo è un meccanismo ATP dipendente (vi è consumo di ATP, che viene idrolizzato ad ADP). Grazie a ciò, nella divisione cellulare del batterio vi sarà una copia del plasmide in ognuna delle due cellule figlie.

Caratteristiche dei plasmidi come vettori di clonaggio

I plasmidi sono ottimi vettori di clonaggio, perché hanno diverse caratteristiche:

• Hanno un basso peso molecolare (cioè poche chilobasi)
• Hanno la capacità di conferire all'ospite un fenotipo facilmente identificabile (e questo rende più semplice selezionare i batteri che sono stati trasformati con il plasmide, da quelli che non sono stati trasformati con il plasmide)
• All'interno dei plasmidi vi è la presenza di una serie di siti unici di restrizione (chiamati anche poli-linker), che sono utili per poter clonare i geni di interesse all'interno dei plasmidi

È utile che il plasmide abbia un basso peso molecolare (cioè costituito da circa 2000-3000 paia di basi), perché il DNA plasmidico non va soggetto a frammentazione meccanica durante la sua preparazione. In genere, un plasmide a basso peso molecolare è presente in più copie all'interno di un batterio, rispetto ad un plasmide ad alto peso molecolare (costituito da circa 20 Kb). [Kb = kilo basi]

Inoltre, più è piccolo il plasmide e più è elevata la probabilità che i siti unici siano effettivamente unici (cioè che non si trovino nelle altre parti del plasmide).

La selezione

Per il plasmide è importante avere una selezione, perché la trasformazione (cioè l'inserimento di un plasmide all'interno di un batterio) non sempre avviene al 100% e quindi devo avere un metodo, per discriminare le cellule che ho trasformato (nelle quali è entrato il plasmide) da quelle che non ho trasformato. Molto spesso, il processo di selezione si basa sulla selezione (che viene fatta con uso) di antibiotici; ad esempio → il plasmide porta il gene per la resistenza ad un antibiotico (come può essere l'ampicillina, la tetraciclina) e nel terreno di coltura io metto l'antibiotico stesso; i batteri che sopravvivono in questo terreno di coltura hanno il plasmide contenente il gene per la resistenza dell'antibiotico che ho inserito. Perciò, i batteri che sopravvivono sono stati trasformati (ovvero il plasmide è giunto all'interno di essi), i batteri che non sopravvivono non sono stati trasformati.

Siti unici di restrizione

È importante che i plasmidi abbiano siti unici di restrizione, perché è necessario dover aprire la molecola del plasmide (cioè da circolare farla diventare lineare) per poter clonare il mio DNA di interesse. [Se vi sono siti unici di restrizione, posso aprire il DNA plasmidico in un sito unico oppure in più siti unici oppure in una regione in cui vi sono una serie di siti unici per il clonaggio; questo rende più semplice il clonaggio del mio DNA di interesse].

Screening bianco-blu

Un altro metodo di screening è quello che viene chiamato Screening bianco-blu, che si basa su una tecnica che sfrutta il prodotto del gene Lac (che è il gene batterico che codifica per la β-galattosidasi, che è un enzima in grado di degradare X-gal permettendo la formazione di un intermedio di colore blu). L'operone Lac è un classico operone batterico di regolazione (che funziona nei batteri). [Libro: pag 90, 91, 92]

Un plasmide viene di solito rappresentato con un circoletto chiuso, con due filamenti (perché è double strand) e dentro di esso possono essere inseriti geni che portano la resistenza ad un dato antibiotico.

Esempio: prendo cellule di E. coli che provo a trasformare con il plasmide (che conferisce la resistenza ad un antibiotico) contenente il mio gene di interesse; tuttavia alcune cellule verranno trasformate, altre no. Se metto queste cellule in un terreno di crescita privo di antibiotico (come il terreno chiamato Luria-Bertani), in esso crescono sia i batteri che non sono stati trasformati con il plasmide, sia i batteri che hanno ricevuto il plasmide. Se invece, metto nel terreno di coltura una certa concentrazione dell'antibiotico di cui il plasmide porta il gene per la resistenza, in questo terreno crescono solo i batteri che sono stati trasformati (che hanno il plasmide usato per la trasformazione).

I plasmidi sono solitamente indipendenti, non integrati nel cromosoma batterico, ma vi sono anche dei plasmidi in grado di integrarsi nel cromosoma batterico: questi non si usano quasi mai in biologia molecolare, perché i plasmidi vengono utilizzati per ottenere grandi quantità di DNA di interesse (grandi quantità, cioè si vogliono ottenere grammi del DNA di interesse). Per avere grandi quantità del DNA di interesse, si vogliono avere tante copie del plasmide in ogni batterio (e i plasmidi integrati nel cromosoma batterico sono uno per ogni batterio).

Tipologie di plasmidi

• Plasmidi high copy number = plasmidi che hanno molte copie (100-200 copie) all'interno del batterio
• Plasmidi low copy number = plasmidi che hanno poche copie (2-3 copie) all'interno del batterio

High copy number e low copy number determinano quante volte il plasmide è in grado di replicare all'interno del batterio ospite. [Libro: da pag 13 a pag 16]

Estrazione del DNA totale da una colonia di batteri

Il terreno Luria-Bertani è un terreno che contiene i componenti minimi necessari per la crescita dei batteri. È noto che la cellula di E. coli si replica ogni 20 minuti. Per sapere quale è la curva di crescita di una coltura batterica si segue (cioè si determina) la sua densità utilizzando lo spettrofotometro. [La curva di crescita è di tipo esponenziale]. Una coltura over-night di solito raggiunge una densità pari a 2 (che è a plateu). [Quindi con l'over-night si arriva a plateu]. [La crescita di un batterio in vitro è bene che non superi mai le 16 ore, poiché altrimenti si ottengono molti batteri morti nella coltura (a causa dalla mancanza di nutrienti, di ossigeno..)].

Procedura di estrazione del DNA

• La coltura batterica viene fatta crescere e viene raccolta. Si può utilizzare il terreno Luria-Bertani.
• Si fa una centrifugazione → centrifugando, il pellet di batteri giunge sul fondo, mentre nel surnatante rimangono il terreno di coltura e i batteri morti.
• Le cellule vengono rimosse e rotte per ottenere un estratto cellulare.
• Si purifica il DNA contenuto nell'estratto cellulare.
• Si concentra il DNA (e si determina la concentrazione usando lo spettrofotometro).

Per rompere la parete batterica: si può fare una lisi meccanica oppure una lisi chimica. Di solito si fa una lisi chimica, mediante l'uso del lisozima che digerisce i composti polimerici della parete batterica, in presenza di EDTA che serve per preservare la struttura della parete batterica. Dopo la lisi meccanica o chimica si ottiene l'estratto cellulare, che viene centrifugato per far sedimentare sul fondo i componenti cellulari e far sì che il DNA, l'RNA e le proteine rimangano in soluzione.

Per separare il DNA dall'RNA e dalle proteine: si fanno purificazioni utilizzando il fenolo-cloroformio, che è una sostanza che rimuove le proteine. Il fenolo-cloroformio si mischia 1:1 con il volume di estratto cellulare. [1:1 → ad esempio: 1mL di estratto cellulare e 1mL di fenolo-cloroformio]. Mischiando il DNA con il fenolo-cloroformio, si ottiene una miscela che deve essere centrifugata → con la centrifugazione, nel surnatante (nello strato acquoso) rimangono il DNA e l'RNA e si ottiene un'interfaccia fenolica di proteine. Per separare l'RNA dal DNA si utilizza un enzima l'RNAasi, che degrada l'RNA per 2 ore a 37°C.

La concentrazione di DNA si misura con lo spettrofotometro e quando la densità (OD) è 1 vuol dire che ho 50 microgrammi di DNA per ml ed è un parametro fisso che leggo a 260nm. Il rapporto tra assorbanza alle lunghezze d'onda (260/280) mi indica la contaminazione proteica, se questo rapporto è inferiore a 1,8 vuol dire che non è una buona purificazione. [Libro: da pag 27 a pag 36]

[tritox-100: è un detergente]

[Le nostre mani sono ricche di RNAasi, che sono distribuite ovunque].

Separazione del DNA tramite conformazione

Un altro metodo che può essere utilizzato per separare il DNA, è quello che si basa sulla sua conformazione (il DNA può assumere struttura lineare oppure superavvolta):

• Applico una denaturazione alcalina al mix di DNA usando buffer a pH basico (con pH di circa 12) → il DNA double strand si separa divenendo DNA lineare a singolo filamento, mentre il DNA plasmidico rimane superavvolto.
• Riporto il DNA a pH neutro, usando un acido → in questo modo, i singoli filamenti vanno a formare quella che è una massa aggrovigliata di DNA. Questa massa avrà un peso maggiore dei DNA superavvolti.
• Faccio una centrifugazione, con la quale la massa aggrovigliata di DNA va a finire in fondo al tubo (in cui si trova). Grazie a ciò, nel surnatante si trovano i plasmidi superavvolti.
• Faccio correre il DNA (per separarlo meglio) in un tubo in cui vi è un gradiente di densità di cesio-cloruro → si usa un tubo di plastica che viene riempito con una soluzione di cesio-cloruro e di etidio-bromuro (che è un intercalante del DNA, grazie al quale il DNA diventa luminescente).

Perciò, si fa una soluzione di cesio-cloruro e di etidio-bromuro e si centrifuga: il DNA assume (nel tubo) una certa posizione, pari alla sua densità. Questo è un tubo in cui vi è un gradiente di densità costante in tutto il tubo di cesio-cloruro (che è un sale) e il DNA banda nel tubo in base al suo peso molecolare → il DNA plasmidico superavvolto starà più in alto (nel tubo), mentre il DNA lineare starà più in basso.

Siccome io voglio ottenere il DNA superavvolto (che rappresenta il mio DNA plasmidico): si fissa il tubo su un supporto e con una siringa si va a bucare il tubo (appena sotto la banda del DNA superavvolto) e si preleva (si aspira) il DNA plasmidico. Il DNA plasmidico, però, contiene ancora il sale (che è cloruro di cesio), perciò si fa un'estrazione del sale usando un alcol (iso-butanolo). Si mescola l'iso-butanolo con la nostra soluzione di DNA (in rapporto 1:1) e si centrifuga → nella fase acquosa vi è il DNA (mentre nella parte "sopra" vi sono l'iso-butanolo e i sali). Si ripete questo varie volte, ottenendo una soluzione pura di DNA.

A volte per togliere i sali si deve fare la dialisi, che è un metodo che viene utilizzato per togliere i sali da una soluzione; con la dialisi (che viene fatta usando un tampone di dialisi), il DNA è contenuto in una membrana di dialisi e il sale esce dalla membrana e va nel tampone di dialisi. Il DNA purificato (che ha una concentrazione molto bassa) viene concentrato, mediante centrifugazione. [Con la centrifugazione si può passare da un DNA con una concentrazione di 0,1µg/µl ad una concentrazione di 1µg/µl (il µg/µl è la concentrazione che si usa di base in laboratorio)].

Prima della centrifugazione si devono aggiungere dei sali e si usa NaAc (sodio acetato) oppure NH₄Ac (ammonio acetato) in presenza di alcol (etanolo).

• Per ogni volume di DNA si mettono: 1/10 di volume di sali e 2 volumi di etanolo [L'alcol serve per centrifugare].
• Con la centrifugazione si forma un pellet sul fondo del tubo, che va lavato con etanolo al 70% (perché deve essere rimosso il sale).

L'NaCl è poco solubile in etanolo al 70%, per questo si preferisce usare NH₄Ac. Dopodiché risospendo il pellet di DNA in acqua (il DNA è solubile in acqua) oppure in una soluzione chiamata TE (soluzione che rende molto stabile il DNA). Poi si usa l'RNAasi che degrada l'RNA. [Libro: da pag 39 a pag 44]

Cromatografia a scambio ionico

Un altro metodo utilizzato nei laboratori, è la purificazione del plasmide mediante colonne cromatografiche a scambio ionico. [Il DNA è carico negativamente per la presenza dei gruppi fosfato].

• Si utilizzano colonne cromatografiche cariche con DEAE (dietilamminoetanolo) che è carico positivamente, grazie ai gruppi amminici. Se ho colonne con carica positiva, il DNA si lega alle cariche positive del DEAE.
• Ho la colonna, carico nella colonna la soluzione di DNA, RNA e proteine (la soluzione la ottengo dopo la rottura della parete batterica) e la faccio passare attraverso la colonna (utilizzo un Buffer neutro, cioè un tampone neutro). Tutto ciò che è carico negativamente si legherà alla colonna.
• Poi faccio un'eluizione, con un buffer ad alto sale → con l'eluizione rompo tutti i legami tra le cariche in modo da ottenere il DNA purificato mediante la colonna.

Il DNA cromosomico non viene eluito, perché assume una conformazione talmente complessa, che non riesce a passare attraverso le maglie della colonna cromatografica (perciò scende solo il DNA plasmidico attraverso le maglie della colonna cromatografica).

[Queste colonne cromatografiche hanno dei limiti: Gli alti pesi molecolari vengono trattenuti nella colonna (come il DNA batterico) e non riesco a purificarli. I bassi pesi molecolari corrono troppo velocemente attraverso la colonna e non li riesco a purificare. Quindi, con queste colonne non riesco a purificare né i bassi pesi molecolari, né gli alti pesi molecolari].

Manipolazione del DNA purificato

Il DNA plasmidico purificato può essere manipolato mediante:

• Nucleasi → che tagliano gli acidi nucleici
• Ligasi → uniscono gli acidi nucleici
• Polimerasi → producono copie del DNA
• Topoisomerasi → introducono superavvolgimenti al DNA circolare covalentemente chiuso (come il DNA plasmidico)

Nucleasi

Esse possono essere:

• Esonucleasi: rimuovono un nucleotide alla volta ad un'estremità; esse tagliano il legame fosfo-diesterico dell'ultimo nucleotide di un filamento double strand di DNA (esse tagliano un nucleotide alla volta).
• Endonucleasi: tagliano legami interni alla molecola, frammentandola in tanti piccoli frammenti.

Tra le esonucleasi, le più utilizzate sono:

• La Bal31
• L'Esonucleasi III

Tra le endonucleasi le più utilizzate sono:

• Endonucleasi S1: taglia DNA a single strand
• DNAasi I: taglia DNA double strand
• Endonucleasi di restrizione

Ligasi

Sono enzimi che riparano una discontinuità che riguarda un singolo filamento oppure un filamento doppio.

Polimerasi

Enzimi che sintetizzano un nuovo filamento di DNA su un DNA stampo; questi enzimi hanno sempre bisogno di un primer e sintetizzano una sequenza complementare al DNA stampo.

La DNA-polimerasi I → se vi è un nick (cioè un'interruzione di alcuni nucleotidi) in un filamento, essa sintetizza (riempiendo il "buco" di nucleotidi nel filamento) a partire dal DNA stampo, rimuovendo tutti i nucleotidi a valle del nick. Questa caratteristica differenzia la DNA-polimerasi I dal frammento di Klenow. Frammento di Klenow → a partire dallo stesso nick, essa riempie solo i nucleotidi riguardanti il nick. [Esso è quello più utilizzato rispetto alla DNA-polimerasi I].

Trascrittasi inversa → sintetizza DNA a partire da un RNA.

Enzimi di modificazione del DNA

• Enzimi che rimuovono il gruppo fosfato al 5' → questi enzimi sono chiamati FOSFATASI ALCALINE
• Enzimi che aggiungono il gruppo fosfato al 5' sono chiamati CHINASI
• Enzima che aggiunge uno o più nucleotidi al 3' deossinucleotidil transferasi terminale