Tecniche di biologia molecolare

Tecniche

Acidi nucleici

1) Elettroforesi su gel: migrazione di DNA o RNA su una matrice porosa direzionata

mediante l’interposizione ai poli di un anodo e un catodo (-> direzione degli acidi verso il

catodo) e visualizzazione della corsa con bromuro d’etidio. Separazione per grandezza (->

molecole più piccole scendono di più). Materiali: poliacrilammide e agarosio -> il primo

riesce a discriminare il DNA diverso per singole bp solo su frammenti di massimo 1 kb (->

capacità di risoluzione alta); agarosio riesce a separare molecole molto lunghe fino a 100

kb (risoluzione inferiore). Se DNA troppo lunghi questi si insinuano nei pori dell’agarosio

compiendo un movimento a zig-zag che compromettono gli esiti delle analisi muovendosi in

modo simile -> elettroforesi a campo pulsante su gel: disposizione di due coppie di elettrodi

sugli angoli del gel e si accendono e spengono alternativamente in modo da orientare il

DNA secondo un percorso a zig-zag (più le dimensioni sono elevare e più ci vorrà per

orientare il DNA); utilizzata per calcolare le dimensioni di genomi batterici ed eucarioti

inferiori (es. funghi). Separazione anche per forma e proprietà topologiche: DNA

supercoiled sono molto più veloci rispetto a quelli non superavvolti o a circolari rilassati.

RNA trattato con gliossale, che forma complessi con i gruppi -NH3 delle basi, per evitare

eventuali appaiamenti che facilitano la formazione di strutture secondarie e terziarie.

2) Frammentazione del DNA: procedura atta alla facilitazione della manipolazione e delle

analisi di DNA in laboratorio; studio di singoli geni da estratti cromosomici -> enzimi di

restrizione – riconoscimento di sequenze di 4-8 nt, spesso palindromiche. EcoRI taglia la

sequenza 5’-GAATTC-3’ che, come le altre sequenze esameriche, si ritrovano mediamente

ogni 4 kb. Se una stessa molecola di DNA viene trattata con più endonucleasi, la molecola

sarebbe digerita in posizioni diverse generando frammenti di dimensioni diverse; con

questo si permette l’isolamento di varie regioni specifiche di DNA. Maggiore è la sequenza

di riconoscimento minore sarà la frequenza di taglio dell’enzima e inoltre alcuni enzimi sono

sensibili alle metilazioni delle basi. Generazione di estremità piatte, come HpaI, o estremità

protruding (sticky), come EcoRI (taglio dei legami fosfodiesterici tra G e A).

3) Ibridazione: uso di una molecola sonda (probe) a sequenza definita, purificata (e

sottoposta a denaturazione del dsDNA) o sintetizzata, marcata chimicamente o

radioattivamente.

Tipi di marcatura:

- Marcatura per incorporazione: sintesi di DNA per PCR in presenza di un precursore

marcato, nucleotidi modificati dotati di fluorescenza o atomi radioattivi (come 32P o 35S

al P alfa); visualizzazione della fluorescenza mediante esposizione del DNA ibridato con

luce UV a lunghezza d’onda appropriata, e della radioattività a un film a raggi X o a un

fotomoltiplicatore che emetta luce in risposta all’emissione di particelle beta da parte dei

marcatori radioattivi.

- Aggiunta di un marcatore all’estremità di un DNA intatto: es. fruizione di una

polinucleotide chinasi che trasferisce il P gamma radioattivo dell’ATP al 5’OH del DNA.

4) Tecniche di blot: per monitorare vaste popolazioni di DNA o RNA simili in dimensioni si

ricorre a tecniche di localizzazione specifica dei vari acidi nucleici, il Southern e il Northern

blot.

- Southern blot: DNA digerito da EcoRI e separato con elettroforesi viene immerso in

una soluzione alcalina (NaOH diluito per 15 min) per favorirne la denaturazione e

posizionato su una membrana positiva di nitrocellulosa o di nylon creando una copia

del gel (blot). Il gel viene ricoperto dalla membrana che presenta al di sopra fogli

assorbenti che tendono ad assorbire per capillarità la soluzione mentre i frammenti di

DNA rimangono adesi alla nitrocellulosa per interazioni elettrostatiche. Si separa in

seguito la membrana dal gel e si saturano le cariche positive mediante DNA eterologo

(di solito proveniente da salmone); posizionamento della membrana positiva in una

soluzione contenente un probe marcato in eccesso rispetto al bersaglio che ibridizza la

nostra sequenza di interesse: la soluzione deve avere una salinità e una temperatura

consone per favorire la denaturazione e la rinaturazione del DNA. Dopodiché si

procede con la visualizzazione del risultato mediante un film per raggi X ottenendo un

autoradiogramma che ci permette di vedere la banda corrispondente all’ibridazione.

- Northern blot: protocollo simile ma dato che gli RNA sono già corti non c’è bisogno

dell’utilizzo di nucleasi per la frammentazione del materiale; si formano ibridi DNA-RNA.

Determinazione di un particolare mRNA presente nel campione per risalire al suo livello

d’espressione oppure risalire ai livelli relativi di uno specifico mRNA nei diversi citotipi.

5) PCR: procedimento biochimico che si effettua in vitro utilizzato per l’amplificazione di una

piccola regione di DNA; i materiali utilizzati constano in:

- DNA da amplificare;

- Primers: oligo-nt complementari alle estremità del frammento;

- Nuceotidi: dATP, dGTP, dCTP e dTTP;

- Taq polimerasi: enzima di batteri termofili

Unisco i vari reagenti della PCR e in seguito si procede con la reazione caratterizzata da 3

fasi principali:

:

- Melting denaturazione del DNA portando a 94°C ( ;

Tm= 16.5 (log[Na])+0.41(%GC)+81.5°C)

- Annealing: abbassamento della temperatura a 55°C per permettere il legame dei

primers alle estremità;

- Extension: innalzamento della temperatura a 72°C temperatura ottimale per la

polimerizzazione da parte della pol

Questo ciclo viene poi ripetuto e si avrà l’amplificazione esponenziale del frammento di

DNA di partenza (fase esponenziale) e al terzo ciclo la reazione avrà una fedeltà maggiore;

di solito non si superano i 30 cicli, poiché si ha un esaurimento dei reagenti (fase di

plateau).

Protocollo sperimentale: isolamento del DNA, preparazione della reazione di PCR, PCR

(avviata nel thermal cycler), analisi in elettroforesi su agarosio.

Isolamento: estrazione del DNA mediante raccoglimento delle cellule e inserimento in

InstaGene Matrix che lega il Mg2+ presente nelle proteasi cellulari, agitazione della

soluzione e dispersione delle cellule. Incubazione a 55°C per la rottura del tessuto e

inattivazione delle proteasi e in seguito nuova incubazione a 100°C per rottura delle

membrane e denaturazione delle proteine (matrice si lega agli ioni Mg2+). Si procede in

seguito alla rimozione della matrice mediante centrifugazione e prelevamento del

supernatante contenente DNA.

Preparazione della reazione: aggiunta di Master Mix contenente nt, primers, tampone

(fosfato), colorante elettroforetico, Taq pol e posizionamento della soluzione risultante con

genoma nel thermal cycler per dare inizio alla reazione di PCR.

Analisi su gel: preparazione della corsa con i v