Tecniche di biologia molecolare

Tecniche di analisi degli acidi nucleici

Elettroforesi su gel

L'elettroforesi su gel è una tecnica utilizzata per la migrazione di DNA o RNA su una matrice porosa direzionata mediante l'interposizione ai poli di un anodo e un catodo, che spinge gli acidi nucleici verso il catodo. La visualizzazione della corsa si effettua con bromuro d'etidio. Questo metodo permette la separazione delle molecole per grandezza: molecole più piccole migrano di più. I materiali utilizzati sono poliacrilammide e agarosio. La poliacrilammide consente di discriminare il DNA diverso per singole basi (bp) solo su frammenti di massimo 1 kb, offrendo un'alta capacità di risoluzione. L'agarosio, invece, è in grado di separare molecole molto lunghe fino a 100 kb, ma con una risoluzione inferiore.

Quando il DNA è troppo lungo, può insinuarsi nei pori dell'agarosio muovendosi a zig-zag, il che compromette gli esiti delle analisi. Per questo si utilizza l'elettroforesi a campo pulsante su gel, dove due coppie di elettrodi agli angoli del gel si accendono e spengono alternativamente, orientando il DNA secondo un percorso a zig-zag. Più le dimensioni del DNA sono elevate, più tempo ci vorrà per orientarlo. Questa tecnica è utilizzata per calcolare le dimensioni di genomi batterici ed eucarioti inferiori, come quelli dei funghi. La separazione avviene anche per forma e proprietà topologiche: il DNA supercoiled migra più velocemente rispetto a quello non superavvolto o a quello circolare rilassato.

L'RNA, trattato con gliossale, forma complessi con i gruppi -NH₃ delle basi per evitare appaiamenti che facilitano la formazione di strutture secondarie e terziarie.

Frammentazione del DNA

La frammentazione del DNA è una procedura utilizzata per facilitare la manipolazione e le analisi di DNA in laboratorio e per lo studio di singoli geni da estratti cromosomici. Gli enzimi di restrizione riconoscono sequenze di 4-8 nucleotidi (nt), spesso palindromiche. Ad esempio, EcoRI taglia la sequenza 5’-GAATTC-3’. Queste sequenze esameriche si ritrovano mediamente ogni 4 kb. Quando una stessa molecola di DNA viene trattata con più endonucleasi, la molecola sarà digerita in posizioni diverse, generando frammenti di dimensioni diverse, permettendo così l'isolamento di varie regioni specifiche di DNA. Più lunga è la sequenza di riconoscimento, minore sarà la frequenza di taglio dell'enzima. Inoltre, alcuni enzimi sono sensibili alle metilazioni delle basi. L'enzima HpaI genera estremità piatte, mentre EcoRI genera estremità protruding (sticky), tagliando i legami fosfodiesterici tra G e A.

Ibridazione

L'ibridazione prevede l'uso di una molecola sonda (probe) a sequenza definita, purificata (e sottoposta a denaturazione del DNA a doppio filamento) o sintetizzata, marcata chimicamente o radioattivamente.

Tipi di marcatura

• Marcatura per incorporazione: viene effettuata durante la sintesi di DNA per PCR in presenza di un precursore marcato, tramite nucleotidi modificati dotati di fluorescenza o atomi radioattivi, come ³²P o ³⁵S. La fluorescenza viene visualizzata mediante esposizione del DNA ibridato a luce UV a lunghezza d'onda appropriata, mentre la radioattività è visualizzata su un film a raggi X o un fotomoltiplicatore che emette luce in risposta all'emissione di particelle beta dai marcatori radioattivi.
• Aggiunta di un marcatore all'estremità di un DNA intatto: ad esempio, si utilizza una polinucleotide chinasi che trasferisce il fosforo gamma radioattivo dall'ATP al 5'OH del DNA.

Tecniche di blot

Le tecniche di blot vengono utilizzate per monitorare vaste popolazioni di DNA o RNA simili in dimensioni, attraverso la localizzazione specifica dei vari acidi nucleici, come il Southern e il Northern blot.

• Southern blot: il DNA digerito da EcoRI e separato con elettroforesi viene immerso in una soluzione alcalina (NaOH diluito per 15 min) per favorire la denaturazione e posizionato su una membrana positiva di nitrocellulosa o di nylon, creando una copia del gel (blot). Il gel è ricoperto da una membrana con fogli assorbenti che assorbono per capillarità la soluzione mentre i frammenti di DNA rimangono adesi alla nitrocellulosa per interazioni elettrostatiche. La membrana viene separata dal gel e le cariche positive vengono saturate con DNA eterologo (di solito proveniente da salmone). Successivamente, la membrana viene posizionata in una soluzione contenente un probe marcato in eccesso rispetto al bersaglio che ibridizza con la sequenza d'interesse. La soluzione deve avere salinità e temperatura adeguate per favorire la denaturazione e rinaturazione del DNA. Infine, il risultato viene visualizzato mediante un film per raggi X, ottenendo un autoradiogramma che permette di vedere la banda corrispondente all'ibridazione.
• Northern blot: il protocollo è simile al Southern blot, ma poiché gli RNA sono già corti, non è necessario l'utilizzo di nucleasi per la frammentazione del materiale. Si formano ibridi DNA-RNA, permettendo la determinazione di un particolare mRNA presente nel campione e di risalire al suo livello d'espressione o ai livelli relativi di uno specifico mRNA nei diversi citotipi.

PCR (Reazione a catena della polimerasi)

La PCR è un procedimento biochimico in vitro utilizzato per l'amplificazione di una piccola regione di DNA. I materiali utilizzati comprendono:

• DNA da amplificare
• Primers: oligonucleotidi complementari alle estremità del frammento
• Nucleotidi: dATP, dGTP, dCTP, dTTP
• Taq polimerasi: enzima derivato da batteri termofili

Unendo i vari reagenti della PCR, si procede con la reazione caratterizzata da tre fasi principali:

• Melting: denaturazione del DNA portandolo a 94°C
• Annealing: abbassamento della temperatura a 55°C per permettere il legame dei primers alle estremità
• Extension: innalzamento della temperatura a 72°C, temperatura ottimale per la polimerizzazione da parte della polimerasi

Questo ciclo viene ripetuto, portando all'amplificazione esponenziale del frammento di DNA di partenza. Di solito non si superano i 30 cicli, poiché si ha un esaurimento dei reagenti (fase di plateau).

Protocollo sperimentale

Il protocollo sperimentale include l'isolamento del DNA, la preparazione della reazione di PCR, l'avvio della PCR nel thermal cycler e l'analisi in elettroforesi su agarosio.

Isolamento: l'estrazione del DNA avviene raccogliendo le cellule e inserendole in InstaGene Matrix, che lega il Mg²⁺ presente nelle proteasi cellulari. La soluzione viene agitata per disperdere le cellule, seguita da incubazione a 55°C per la rottura del tessuto e l'inattivazione delle proteasi. Successivamente, un'altra incubazione a 100°C rompe le membrane e denatura le proteine, mentre la matrice si lega agli ioni Mg²⁺. La matrice viene rimossa mediante centrifugazione, prelevando il supernatante contenente DNA.

Preparazione della reazione: si aggiunge Master Mix contenente nucleotidi, primers, tampone (fosfato), colorante elettroforetico e Taq polimerasi. La soluzione risultante viene posizionata con il genoma nel thermal cycler per avviare la reazione di PCR.

Analisi su gel: si prepara la corsa con i vari campioni sul gel di agarosio per analizzare i risultati.