Tecniche di biologia molecolare e cellulare

Appunti di tecnologie molecolari e cellulari

Capitolo 1 – Le colture cellulari

La tecnologia delle colture cellulari consiste nel far crescere e proliferare cellule, eucariotiche o procariotiche, in ambienti artificialmente controllati con appositi nutrienti e in condizione di isolamento; l’ambiente sfruttato nella creazione di una coltura cellulare dipenderà ovviamente dalla tipologia cellulare di interesse. Ad oggi, le colture cellulari hanno la valenza di reagenti per la produzione di proteine ricombinanti (anticorpi ricombinanti, vaccini, etc) nell’ambito industriale, mentre nell’ambito di ricerca costituiscono degli strumenti per effettuare studi nell’ambito della biologia cellulare (microbiologia, farmacologia, biochimica, etc).

Nell’effettuare una coltura cellulare uno dei maggiori problemi consiste nella contaminazione per opera di batteri o altro materiale estraneo (in seguito a contaminazione l’esperimento necessita di venir ricondotto da capo infatti); per minimizzare il rischio di contaminazione la procedura standard nella creazione di colture cellulari prevede di lavora sotto cappa aspirante e di introdurre nella coltura (al momento della sua creazione) un mix di antibiotici (solitamente penicillina e streptomicina).

Sulla base della loro durata è possibile distinguere colture cellulari primarie (esse hanno una durata limitata nel tempo) e secondarie (le cellule che compongono la coltura sono in grado di crescere indefinitamente). Le linee cellulari continue sono essenzialmente cellule trasformate, ossia cellule derivate da tumori oppure cellule che hanno subito una modificazione genetica che le ha rese capaci di crescere indefinitamente (la capacità di una linea cellulare di immortalizzare dipende essenzialmente dalla specie di provenienza).

La prima linea cellulare umana continua è stata la linea delle cellule HeLa, ottenuta nel 1952 da un carcinoma della cervice uterina; questa linea cellulare si è dimostrata di valore incommensurabile per la ricerca sulle cellule umane e tuttora rappresenta uno dei modelli di cellula più usati in laboratorio anche se ne esistono ad oggi centinaia. Avere a disposizione delle linee cellulari immortali su cui effettuare un esperimento costituisce un vantaggio enorme dato che potenzialmente ogni qualsiasi altro laboratorio nel mondo può ripetere l’esperimento da noi effettuato purché proceda all’acquisto della medesima linea cellulare, anche se va tenuto sempre in considerazione che esse possono potenzialmente differire molto da una qualsiasi altra linea cellulare ottenuta direttamente da un nostro tessuto.

Nel 1955 ci si soffermò per la prima volta sullo studio dei nutrienti fondamentali per la realizzazione di un terreno di coltura atto alla crescita di una particolare linea cellulare (ciò ha permesso una standardizzazione chimica dei terreni utilizzati per la coltura delle singole tipologie cellulari), mentre nel 1965 fu realizzato il primo terreno di coltura “serum-free” ossia privo di siero, che essendo un liquido biologico prelevato direttamente da animali (non prodotto artificialmente) è capace di introdurre numerose variabili nel sistema di coltura cellulare come ad esempio la sua concentrazione ed eventuale contaminazione. La realizzazione di terreni privi di siero ha permesso una ulteriore uniformazione dei terreni di coltura.

Componenti fondamentali nella realizzazione di una coltura cellulare

• Terreni di crescita dalla chimica definita
• Antibiotici
• Tripsina

Le colture cellulari risultano estremamente utili negli studi di biologia cellulare (per lo studio di crescita e metabolismo cellulare), biologia molecolare (per lo studio di tutto ciò che riguarda l’espressione), genetica (per lo studio di mutazioni), citogenetica (per effettuare diagnosi cliniche), oncologia (per la caratterizzazione tumorale), farmacologia (per lo studio di efficacia e citotossicità di farmaci) e biotecnologie (per la produzione di proteine ricombinanti e anticorpi monoclonali).

Vantaggi delle colture cellulari

• Ad oggi praticamente qualsiasi componente necessaria alla realizzazione della coltura risulta acquistabile (non vi è la necessità di preparare nulla in laboratorio)
• Sussiste un’abbondante bibliografia sulle modalità con la quale effettuare le diverse tipologie colture
• Vi è la possibilità di controllare qualsiasi variabile sperimentale legata alla coltura (pH, temperatura, etc)
• Sono disponibili centinaia di linee cellulari derivati da organismi diversi
• Possibilità di replicare l’esperimento in maniera molto semplice
• Ampio range di dimensione delle colture cellulari (posso arrivare a colture cellulare anche di centinaia o migliaia di litri)
• Riduzione del numero di animali da utilizzare per un singolo studio

Svantaggi delle colture cellulari

• Costo molto elevato dei materiali per realizzare le colture cellulari (soprattutto i terreni e la plastica, entrambi usa e getta)
• Metodo abbastanza laborioso (alcune tipologie cellulari richiedono controlli continui)
• Rappresenta un sistema molto semplificato se paragonato ad un organismo in toto (spesso infatti risulta difficile correlare i risultati ottenuti in vitro con quelli in vivo)

Tipologie di colture cellulari

Sulla base della natura delle cellule che costituiscono una coltura cellulare è possibile distinguere colture le cui cellule aderiscono su di un supporto o substrato (essenzialmente plastica) e colture le cui cellule rimangono in sospensione; avremo pertanto colture aderenti e colture in sospensione. Nelle colture aderenti le cellule interagiscono con il supporto solido attraverso fibronectina e altre proteine della matrice (in modo indiretto, coinvolgendo la matrice) oppure attraverso integrine e altre proteine di membrana (in modo diretto) e la forza di adesione delle cellule al substrato varia all’interno della singola coltura; nelle colture in sospensione invece, le cellule in sospensione non formano iterazioni fisiche con il vitro. La maggior parte delle linee cellulari primarie e secondarie crescono aderendo ad un substrato, tanto che le cellule che necessitano di crescere in sospensione sono essenzialmente solo quelle di derivazione emopoietica (normalmente in coltura esse risultano rotonde, presentanti dei margini ben definiti e di dimensione regolare).

Crescita delle colture cellulari e passaggio in coltura

Le cellule all’interno di una coltura crescono in numero nel tempo e l’andamento della crescita risulta sostanzialmente simile per tutte le tipologie cellulari. Le diverse fasi della crescita cellulare consistono in:

• Fase di latenza; durante questa fase le cellule immesse all’interno del terreno si assestano nello stesso e non aumentano in numero (la durata di questa fase dipende dal tipo cellulare)
• Fase esponenziale; in questa fase il quantitativo di cellule nella coltura cresce esponenzialmente in modo dipendente dal tipo cellulare (le diverse tipologie cellulari presentano tempi di duplicazione diversi)
• Fase stazionaria; in questa fase il numero di cellule nella coltura rimane costante data confluenza
• Fase di declino; in questa fase si riduce il numero di cellule vive in coltura

Al fine di mantenere la linea cellulare target in coltura per molto tempo è necessario effettuare dei passaggi in coltura delle cellula ogni qualvolta stia per essere raggiunta la fase stazionaria (in questo modo si evita il sopraggiungere della fase di declino); il passaggio delle cellule è necessario che avvenga correttamente così da non stressare troppo le cellule ed è anche necessario prendere nota di ogni passaggio effettuato in quanto con l’aumentare dei passaggi le cellule iniziano a modificarsi. Ogni volta che scongelo una linea cellulare per effettuare una coltura, dovrei togliere alcune cellule dopo pochi passaggi e ricongelarle così da disporre sempre di cellule “backup”.

Il passaggio delle cellule in coltura viene effettuato in 2 modi diversi a seconda della natura delle cellule:

• Nel caso di cellule in sospensione, devo prenderne un certo volume di coltura e diluirlo in un terreno nuovo preriscaldato a 37°C. Solitamente si preleva circa 1/3 della quantità totale di terreno vecchio e lo si pone in una quantità doppia di nuovo.
• Nel caso di cellule aderenti ad un substrato, si procede allontanando il surnatante, lavando le cellule (solitamente con PBS) in modo da allontanare le cellule morte ed il siero, allontanando il PBS, aggiungendo una soluzione di tripsina ed EDTA (la prima agisce digerendo le proteine presenti sulla superficie delle cellule, mentre il secondo chela gli ioni calcio alterando le interazioni mantenute dalle integrine di membrana della cellule) in modo da staccare fisicamente le cellule dal supporto solido, aggiungendo poi del siero in modo da inattivare la tripsina (questa agirà preferenzialmente sulle proteine del siero), effettuando una centrifugazione a basso numero di giri (circa 180 giri) così da separare le cellule dal surnatante e aggiungendo in fine le cellule in una nuova flask riscaldata.

Diversamente dalle cellule in sospensione, nelle cellule aderenti l’eccessiva confluenza (percentuale della superficie occupata dalle cellule) è in grado di portare a cambiamenti della loro morfologia; per questo motivo il passaggio, nel caso di cellule aderenti, necessita di venir effettuato quando la confluenza raggiunge il 70-80% (al 100% la coltura risulta già in fase stazionaria e pertanto le cellule risultano già eccessivamente sofferenti).

Le colture cellulari a breve e lungo termine

Le colture cellulari possono distinguersi in colture a breve termine (il numero di cicli cellulari a cui vanno incontro queste cellule è molto ridotto) e a lungo termine (le cellule appartenenti a questa tipologia di coltura vanno in contro ad un numero molto grande di divisioni cellulari che può potenzialmente divenire infinito). Delle colture cellulari a breve termine fanno parte le colture primarie, ossia colture nelle quali le cellule provengono direttamente dal campione di studio (ossia un tessuto di un embrione o un adulto), e colture secondarie; nelle colture primarie solitamente sarà presente una miscela eterogena di cellule provenienti tutte dal tessuto target (alcune delle cellule presenti nel campione primario potranno necessitare di una crescita in sospensione mentre altre di una crescita in adesione). Dalle colture primarie è possibile ottenere in laboratorio delle colture secondarie a seguito di un passaggio in colture di cellule provenienti da colture primarie una volta che queste hanno raggiunto un elevato grado di confluenza; le colture secondarie risultano simili alle colture primarie tuttavia, a seconda del quantitativo di passaggi a cui sono state sottoposte, le cellule potranno differire molto dal tessuto di partenza in quanto nel mix di cellule inizialmente presente nella coltura primaria vi saranno delle cellule con un grande tasso proliferativo (in molti casi tali cellule sono i fibroblasti) che con l’aumentare dei passaggi prenderanno il sopravvento all’interno della coltura secondaria. Per via di quanto detto precedentemente, le colture primarie pur avendo una durata molto limitata presentano il vantaggio di essere più rappresentative della condizione in vivo rispetto alle colture secondarie (con l’aumentare dei passaggi aumenta la differenza delle colture secondarie dalla condizione in vivo).

Le colture primarie animali vengono utilizzate ad esempio per lo studio di linfociti/timociti, macrofagi, fibroblasti oppure cellule embrionali di fegato o cuore. Al fine di ottenere una coltura primaria è necessario procedere nel seguente modo:

• Prelevare le cellule dal campione (embrione o adulto) mediante dissezione meccanica
• Trattare enzimaticamente e/o meccanicamente il tessuto così da disgregarlo eliminando i contatti tra le cellule in esso contenute (passaggio di dissociazione)
• Aggiungere inibitori enzimatici in modo da bloccare la digestione enzimatica che si ha con il trattamento enzimatico
• Effettuare un controllo della vitalità cellulare in modo da stimare il quantitativo di cellule morte in seguito al trattamento (solitamente si utilizza trypan blue in grado di colorare selettivamente le cellule morte)
• Seminare le cellule su di una piastra Petri oppure in una flask

Il passaggio di dissociazione può venir effettuato meccanicamente o mediante l’utilizzo di particolari enzimi; solitamente si procede effettuando una trattazione enzimatica preceduta però da una dissociazione meccanica in cui attraverso delle forbici o altri strumenti si sminuzza il campione così da massimizzare la superficie di contatto del tessuto con gli enzimi utilizzati successivamente. Gli enzimi utilizzati per la dissociazione agiscono degradando le proteine della matrice extracellulare con la quale interagiscono le integrine presenti sulla superficie delle cellule del tessuto; vi è la possibilità di utilizzare diversi enzimi (tripsina, papaina, collagenasi, etc) a seconda del tessuto trattato (solitamente viene utilizzato un mix di più enzimi che prende il nome di reagente di dissociazione). Nel caso si stia lavorando con campioni particolari, contenenti ad esempio un grosso quantitativo di tessuto connettivo, può risultare necessario l’impiego (in aggiunta eventualmente a quanto detto precedentemente) di una dissociazione meccanica mediante l’utilizzo di un pestello, di una siringa dotata di ago aspirante (il tessuto passando attraverso l’ago si disgrega) e di un filtro in nylon/acciaio dotato di pori capaci di permettere il passaggio unicamente di singole cellule durante centrifugazione. La principale differenza della dissociazione meccanica e di quella enzimatica consiste nel quantitativo di cellule morte durante il passaggio, tale quantitativo sarà maggiore nel caso della dissociazione meccanica (tuttavia risulterà maggiore la percentuale di prodotto finale costituito da singole cellule).

Un esempio di cellule umane utilizzate per la realizzazione di colture primarie è dato dalle HUVEC ossia cellule endoteliali umane della vena ombelicale. Le HUVEC sono le cellule umane più utilizzate per la realizzazione di colture primarie e vengono recuperate dalla vena ombelicale presente nel cordone ombelicale dopo il suo taglio; esse vengono utilizzate per la realizzazione di molte tipologie di esperimenti (soprattutto di interesse vascolare). Il prelievo delle HUVEC a partire dal cordone ombelicale va effettuato sotto cappa ed è necessario inizialmente effettuare un lavaggio del cordone e della vena (per il lavaggio di quest’ultimo si sfrutta una valvola a 3 vie inserita ad una estremità della vena attraverso cui viene fatto passare del terreno di coltura) per poi iniettare della collagenasi nella vena (per permettere il distacco delle cellule endoteliali dalla matrice) e successivamente raccogliere le cellule endoteliali all’interno di una provetta Falcon (posso centrifugare la provetta per separare le cellule dal terreno di coltura in modo poi da risospenderle all’interno di una flask).

Oltre alle HUVEC esistono anche altre cellule umane molto utilizzate per la creazione di colture primarie (fibroblasti provenienti da polmone oppure cheratinociti provenienti dall’epidermide).

Linee cellulari continue e colture a lungo termine

Le linee cellulari continue consistono in cellule presentanti la capacità di crescere indefinitamente variando poco nel tempo (rimangono abbastanza simili nel tempo); questo genere di cellule è quello maggiormente utilizzato all’interno dei laboratori biologici a fini sperimentali. Le linee cellulari continue sono essenzialmente cellule trasformate, ossia cellule derivate da tumori oppure cellule che hanno subito una modificazione genetica che le ha rese capaci di crescere indefinitamente; la capacità di crescere indefinitamente dipende molto dalle specie da cui derivano le cellule in quanto ad esempio le cellule normali di pollo muoiono dopo pochi cicli replicativi e solo raramente si trasformano dando origine a cellule immortalizzate.

Per l’ottenimento di una linea continua di cellule immortalizzate è necessario partire da una coltura primaria di cellule, questa deve essere fatta crescere in modo da ottenere successivamente delle colture secondarie di linee cellulari secondarie; all’aumentare dei passaggi in coltura aumenta anche il quantitativo di cellule disponibili, tuttavia normalmente ciò non prosegue all’infinito in quanto dopo un numero massimo di cicli cellulari le singole cellule perdono la capacità di dividersi divenendo così senescenti, anche se un piccolo quantitativo di cellule (a causa di mutazioni spontanee) talvolta risulterà capace di crescere indefinitamente portando così alla genesi di una linea cellulare continua. Normalmente in laboratorio le cellule immortalizzate sono ottenute attraverso il metodo descritto in precedenza e che si basa sullo sviluppo di mutazioni spontanee oppure attraverso l’utilizzo di cellule provenienti da una coltura primaria in cui vengono indotte forzatamente delle mutazioni (in entrambi i casi le mutazioni è necessario avvengano a livello di precisi geni target); i punti all’interno delle colture cellulari nella quale è possibile osservare delle linee immortali vengono detti “foci di trasformazione” e sono riconoscibili in quanto le cellule cominciano a dividersi dando origine a delle asse tridimensionali di cellule accatastate sul monolayer.

Alcuni esempi di linee cellulari immortali sono:

• 3T3; sono cellule immortali ottenute nel 1962 da fibroblasti di topo a causa di mutazioni spontanee
• MDCK; sono cellule immortali ottenute nel 1958 da cellule epiteliali di rene di cane
• SH-SY5Y; sono cellule immortali ottenute nel 1978 da cellule di neuroblastoma umano (sono molto utilizzate in esperimenti di differenziamento neuronale in quanto aggiungendo acido retinoico ad una loro coltura esse si differenziano molto bene)
• HEK 293; sono