Tecniche di biologia molecolare e cellulare

Metodi immunometrici

• Elevata specificità
• Applicabilità su campioni di diversa natura (siero, urine, latte, feci, etc)
• Basso limite di rivelazione (vi è la possibilità di rilevare l'antigene in volumi molto piccoli del campione)
• Alta produttività analitica (ossia l'analisi richiede poco tempo)
• Possibilità di automazione (ciò aumenta la velocità dell'analisi e la sua accuratezza diminuendo al contempo i tempi d'analisi e la possibilità di errore)

La costante di affinità viene comunemente detta costante di equilibrio (Keq) ed è essenzialmente calcolabile come il rapporto tra la costante di associazione e quella di dissociazione (essa rappresenta il valore della costante di affinità in condizione di equilibrio ed è pertanto calcolabile anche come la quantità di anticorpi che in tale condizione si attaccano all'antigene diviso la quantità di anticorpi che si staccano dall'antigene); il valore della costante di equilibrio è essenzialmente indipendente dalla concentrazione (ossia dalla quantità) di antigene e anticorpo in soluzione ma risulta invece estremamente legato a:

• Natura dell'antigene e dell'anticorpo;
• Mezzo di reazione (essenzialmente il pH della soluzione);
• Temperatura di reazione (essa varia la cinetica con la quale avviene la reazione);

Il valore della costante di equilibrio di un anticorpo nei confronti di un antigene risulta

Estremamente importante per lo sviluppo di un test immunometrico; gli anticorpi solitamente utilizzati per effettuare dei test immunometrici presentano un valore di Keq (nei confronti dell'antigene che riconoscono) compreso tra 10^10 e 10^12 (tali valori sono tipici di IgG ottenute a seguito di ipermutazione somatica dei linfociti B). Il valore di Keq di un anticorpo è calcolabile attraverso una precisa metodica che mi permette di ottenere uno Scatchard dot.

Classificazione dei metodi immunometrici

I metodi immunometrici possono essere distinti in due grandi famiglie:

• Competitivi; in essi si ha una quantità di antigeni in soluzione (capaci di legare l'anticorpo) in eccesso
• Non competitivi; in essi si ha una quantità di anticorpo superiore a quella di antigene

Sulla base della necessità o meno di effettuare dei lavaggi del mezzo di reazione dopo l'avvento del legame tra antigene ed anticorpo (al fine di allontanare tutto ciò che

una prima rilevazione del segnale ottenuto dal tracciante a seguito di una analisi in cui aggiungo ad una quantità di anticorpo una quantità di antigene marcato capace di saturare tutti gli anticorpi in soluzione (prima della rilevazione effettuo un lavaggio degli antigeni in eccesso);

• Effettuo successive rilevazioni del segnale ottenuto dal tracciante a seguito di analisi in cui aggiungo alla medesima quantità di anticorpo la medesima quantità di antigene marcato (quantità capace di saturare tutti gli anticorpi in soluzione) e una quantità progressivamente maggiore di antigene non marcato (prima della rilevazione effettuo sempre un lavaggio degli antigeni in eccesso);
• Utilizzo i risultati ottenuti da tutte le rilevazioni per creare una curva di calibrazione (o curva standard) presentante sull'asse X il logaritmo della concentrazione dell'analita non marcato e in Y il rapporto B0/B (B0 rappresenta il segnale in assenza

Il quantitativo di antigene presente in soluzione sarà proporzionale al segnale ottenuto dal tracciante (esso sarà legato ad uno dei due anticorpi utilizzati). I metodi non competitivi a sandwich, siccome prevedono il legame dell'antigene di interesse a due anticorpi, possono venir sfruttati solamente nel caso in cui l'antigene risulti abbastanza grande da poter essere legato contemporaneamente da entrambi gli anticorpi (solitamente tali antigeni sono antigeni proteici).

Per la quantificazione di un analita attraverso un metodo non competitivo a sandwich sarà quindi necessario:

• Effettuare diverse analisi (a concentrazione crescente di antigene) in cui ad una superficie su cui è legata una certa quantità di anticorpo (in eccesso rispetto alla quantità di antigene usato per la sperimentazione) aggiungo l'antigene, poi (dopo incubazione) l'anticorpo marcato ed infine effettuo un lavaggio dell'eccesso di anticorpo marcato.

(non legantel’antigene) seguito dall’addizione del substrato convertitodall’enzima che agisce da tracciante;

• Effettuo una quantificazione dei segnali ottenuti da tutte lesperimentazioni e creo una curva standard (una sigmoide)presentante sull’asse X la concentrazione dell’analita esull’asse Y l’intensità del segnale;
• Attraverso la curva di calibrazione ottenuta posso calcolare laquantità di analita presente nella soluzione di interesse;

Nei metodi non competitivi di tipo sandwich la curva standard èrappresentata da una sigmoide e non da una retta, in quanto aconcentrazioni molto basse dell’analita l’anticorpo marcato lega inminima parte l’anticorpo non marcato andando portando asovrastimare l’antigene in soluzione, mentre a concentrazione moltoalta dell’analita si ha una saturazione di tutti gli anticorpi non marcaticon conseguente sottostima dell’antigene in soluzione.

Metodi

non competitivi omogenei

I metodi non competitivi omogenei a differenza dei precedenti metodi a "sandwich" sono talvolta vantaggiosi in termini di tempo in quanto non richiedono di effettuare dei lavaggi; in questi metodi vengono struttati 2 anticorpi entrambi marcati (agiscono entrambi da traccianti) ma capaci di generare un segnale solamente quando entrambi, riconoscendo epitopi diversi, legano contemporaneamente l'antigene (essi si legano in due posizioni vicine dell'antigene e a seguito dell'aggiunta di un substrato per una reazione enzimatica essi andranno a trasformarlo rispettivamente in prodotto intermedio e prodotto finale quantificabile).

Questi metodi sono poco utilizzati in quanto presentano un livello molto elevato di interferenza (essa viene spiegata nel paragrafo successivo).

L'interferenza nei metodi immunometrici

L'interferenza è un fenomeno che caratterizza tutti i metodi immunometrici e che è dovuto alla

complessità della mezzo nella quale avviene l'analisi (l'analisi su siero genera sicuramente un