Strutture e interiezioni molecolari

Strutture e interazioni molecolari

Relazioni tra struttura e funzione

- Biomolecole: dalla struttura della molecola si determina la funzione.

- Reti metaboliche (synthetic biology): modifiche specifiche per modificare il metabolismo di un organismo.

- Ecosistemi (consorzi microbici): modifica di un ecosistema per ottenere uno scopo prefissato (esempio: degradazione di sostanza inquinanti).

Origine delle strutture biologiche

Secondo il principio della termodinamica e dell'entropia, le molecole che troviamo nei sistemi viventi sono altamente organizzate e complesse. Queste caratteristiche sono in contrasto con il secondo principio della termodinamica (i sistemi isolati tendono, spontaneamente, a stati sempre più omogenei). Il sistema vivente è tutt’altro che omogeneo (sia in termini di molecola che di organismo): com’è possibile che nel corso degli anni si siano originati dei sistemi disomogenei come gli esseri viventi?

La "vita" è fatta di oggetti organizzati: le biomolecole (proteine e acidi nucleici) sono l’unica classe di molecole ad avere una funzione. Esempio: la CO o l’acqua sono molecole prive di funzione.

Proteine come nanodispositivi

Le proteine vengono definite nanodispositivi perché sono molecole con una funzione. Un dispositivo molecolare si genera mediante un processo chiamato selezione naturale. L’approccio con cui si studiano queste biomolecole/proteine è l’ingegneria inversa: si vuole determinare la funzione di un "dispositivo" studiandone la struttura.

In generale, dopo aver isolato una molecola bisogna capirne la funzione (proteasi, lipasi, etc) e, successivamente, studiarne la struttura tridimensionale; dopo aver determinato la struttura e la funzione bisogna capire che relazione c’è tra le due. Se è possibile, si può studiare il ruolo di ogni componente del "device". Esistono dei sistemi computazionali che ci possono aiutare in uno o più di questi passaggi.

Perché la selezione naturale ha scelto queste molecole per il "device" della vita sulla terra? Le proteine sono polimeri formati da amminoacidi che discendono da proteine ancestrali (hanno un albero genealogico).

• Perché sono polimeri? Una delle caratteristiche fondamentali del processo "vita" è che è robusta: si adatta a cambiamenti ambientali. Le macchine che la fanno funzionare sono polimeri formati da 20 amminoacidi (monomeri). Qual è il vantaggio di avere 20 monomeri? Avere un infinito numero di possibilità di costruire polimeri diversi.
• La funzione di una proteina è un concetto relativo o assoluto? È relativo perché dipende dall’intorno, cioè dall’ambiente in cui si trova.

Nel corso della selezione naturale viene "selezionato" un codice genetico plastico/adattabile. In linea di principio, un biotecnologo ha uno spazio creativo enorme (infinito).

• Le proteine hanno un albero genealogico: è vantaggioso? Il processo storico ci può aiutare a comprendere la funzione di una proteina isolata dall’organismo: comparare "device" filogeneticamente correlati consente di determinare quali sono le componenti fondamentali per la sua funzione.

Esempio: emoglobina la troviamo in organismi diversi: se la comparo possono notare la presenza di porzioni conservate, cioè fondamentali per la sua funzione. Il confronto di sequenze proteiche che sono, dal punto di vista filogenetico, correlate mi permette di ottenere informazioni sulla funzione confronto di proteine omologhe: dobbiamo imparare a comparare due o più sequenze proteiche per capire se sono omologhe o meno.

Ingegneria inversa delle idrogenasi

Sono enzimi promettenti dal punto di vista biotecnologico e catalizzano la conversione reversibile di protoni ed elettroni in idrogeno molecolare e viceversa. Il sole è la fonte principale di energia sulla terra, ma non l’unica; fonte significa che viene prodotta energia da questa. Il petrolio non è una fonte, ma un oggetto che racchiude energia. Il petrolio è biomassa che non sono stati "processati" che dalla superficie terrestre sono scesi portando ad ottenere composti che si possono usare per fare energia; il petrolio è un carrier energetico. L’energia che è racchiusa nel petrolio deriva dal sole: fotosintesi (energia del sole trasforma CO₂ e H₂O in zuccheri e ossigeno, quindi molecole organiche e ossigeno che poi ritroviamo in CO₂ e H₂O). Noi non usiamo l’energia del sole come energia primaria, ma carboidrati e ossigeno che vengono trasformati in CO₂ e H₂O.

Quindi:

• Sole→fonte di energia
• Petrolio→vettore energetico

Gli esseri umani hanno scoperto come fare la respirazione artificiale fuori dagli organismi viventi: implica che devo consumare i combustibili fossili, che però non sono infiniti. Serve quindi trovare per le generazioni future dei nuovi carrier energetici. Quando si bruciano combustibili fossili inoltre si produce molta CO₂→cambiamenti climatici. Tutto questo porta la comunità scientifica per motivi umanitari ed economici a sviluppare carrier energetici innovativi.

Altra fonte di energia può essere l’energia geotermica oppure anche l’energia nucleare. Quindi le 3 fonti energia a cui si può attingere sono:

• Sole
• Energia geotermica
• Energia nucleare

L’idea è di prendere l’energia solare per far avvenire una reazione che non è spontanea: rompere l’acqua in O₂ e H₂ (idrogeno e ossigeno molecolari). Questo è interessante perché:

• Il sole "costa poco"
• Di acqua sul pianeta ce n'è tanta

Ossigeno e idrogeno possono essere fatti reagire di nuovo per fare energia. Alcune macchine di oggi vanno a idrogeno e contengono una cella a combustibile: è praticamente una pila dove O₂ reagisce con H₂ formando l’acqua con una reazione di ossidoriduzione (ossigeno si riduce e idrogeno si ossida) e questa reazione libera molta energia.

Uso quando la luce del sole per formare idrogeno e ossigeno, quando serve energia li faccio reagire. L’altro vantaggio è che quando brucio tipicamente benzina produco CO₂, se brucio H₂+O₂ produco H₂O non CO₂ con impatto ambientale nullo. L’idrogeno è un carrier energetico molto promettente perché la molecola H₂ contiene molta energia. Ma l’H₂ bisogna produrlo e non è facile perché la reazione è molto lenta.

La reazione di catalisi dell’idrogeno viene effettuata da alcune molecole, la comunità biotecnologica si sta concentrando in questo: la scissione dell’H₂O a formare H₂ e O₂ è una reazione che alcuni organismi viventi sanno analizzare, in particolare ci sono una serie di proteine (fotosistemi nelle piante) che sono capaci di liberare elettroni e protoni, che possono essere convertiti in H₂ e O₂ da usare nella cella combustibile. Le idrogenasi quindi in ambito biotech sono molto studiate.

Per fare ingegneria proteica bisogna conoscere:

• Struttura dell’idrogenasi
• Funzione dell’idrogenasi

Esistono 3 famiglie filogeneticamente distinte di idrogenasi (non hanno alcuna relazione di parentela) ma quella più studiata è la famiglia delle ferro-ferro idrogenasi ([Fe-Fe]-idrogenasi). La struttura è stata scoperta 20 anni fa: mediante difrazione a raggi X è stata determinata la struttura del sito attivo dell’enzima→ci sono 2 atomi di ferro (elemento comune sulla terra), l’atomo di ferro a sinistra è legato mediante lo zolfo alla catena laterale della cisteina, questo zolfo della cisteina a sua volta è legato ad un altro cofattore, l’S Fe (cluster 4 ferro 4 zolfo, es: ferrodossine).

Questo cofattore, dal punto di vista geometrico, forma una specie di "cubetto" a cui vertici abbiamo atomi di zolfo e ferro. Inoltre, il ferro di sinistra lega uno ione cianuro (CN^-) e una molecola di monossido di carbonio (CO) che agiscono in modo inusuale, infatti in un sistema vivente “lo ammazza” se diamo CO e CN essendo dei veleni altamente reattivi. Abbiamo un'altra molecola di C=O che agisce da ponte tra i due atomi di ferro. Il ferro di destra lega una molecola di acqua (al posto dell’amminoacido cisteina), una di CN e una di CO. I due atomi di ferro legano una molecola organica che viene sintetizzata dalla cellula e agisce da ponte; la molecola è formata da S-CH₂-X-CH₂-S (X: azoto di un’ammina).

Le idrogenasi le troviamo in molti batteri e in alcuni eucarioti, ma sono molto presenti in microalghe, quindi in organismi che vivono sia in condizioni estreme ma anche in condizioni normali; si è scoperto che in questi organismi ci sono dei pathway biosintetici che sintetizzano CN e CO. Queste molecole non sono presenti nell’ambiente quindi l’organismo deve usare energia per sintetizzarli: qual è la fonte energetica? Il meccanismo catalitico delle idrogenasi:

• Stato redox/ossidazione del Fe: +1 stato redox instabile; è richiesto una modulazione dell’intorno affinché venga mantenuto (CO e CN).

L’ammina porta due protoni (H⁺) uno dei quali è “vicino” al Fe⁺; essendo il ferro elettron-ricco tende ad acquisire l’H⁺. Tra il ferro e l’idrogeno è più elettronegativo l’idrogeno perché passa da H⁺ a H^- (idruro) mentre il ferro diventa Fe²⁺. All’azoto si lega un nuovo H⁺ che in vicinanza dell’H^- legato al ferro di destra si lega ad esso portando alla formazione di H₂.

Le idrogenasi vengono inattivate in presenza di ossigeno.

Domande frequenti

• Perché due ioni ferro e non uno? Ogni ione ferro dona un elettrone.
• Perché l’ammina in questo modo? Per mettere vicino l’H⁺ e l’H^-.
• Presenza di CO e CN? Mantenere Fe⁺.
• Perché l’enzima viene inattivato dall’ossigeno? Perché in presenza del ferro +1 avviene l’ossidazione.

Pensando a processi redox a livello biologico, il trasferimento di elettroni in biologia è sempre associato al trasferimento di protoni→trasferimento accoppiato elettrone-protone. Per progettare dei sistemi di trasferimento elettronico o protonico, si sa che spesso sono associati. Ma perché?

Perché quando si trasferisce un elettrone l’affinità protonica della molecola da cui l’elettrone arriva tenderà ad aver maggiore tendenza a volere protoni; viceversa per quanto riguarda il protone se questo viene ceduto tenderà a voler un elettrone→i processi sono associati perché uno promuove l’altro. Il complesso, qualsiasi sia la molecola se lega un protone la carica positiva diventa più positivo e ha più affinità per gli elettroni. Guardando i meccanismi catalitici è importante chiedersi perché i reagenti “entrano in gioco” in un certo momento.

Il protone si lega solo a 1 degli atomi di Fe, perché strappa 1 elettrone per ognuno allora? Un H⁺ si attacca al Fe ed essendo più elettronegativo→diventa gli elettroni si spostano su H^- H^-, si è preso quindi 2 elettroniche Fe¹⁺ diventa transientemente Fe³⁺. Fe³⁺ vicino a Fe¹⁺ porta a Fe³⁺ che ha alta avidità di elettroni e trova facilmente elettroni da un Fe ricco di elettroni che è Fe²⁺→Fe²⁺ e Fe²⁺.

Il protone e il successivo elettrone arrivano insieme, ma perché insieme e nello stesso momento? Arriva un H⁺ perché c’è una porzione del catalizzatore che ha un’alta avidità per gli elettroni (l’azoto dell’ammina). L’azoto dell’ammina ha 4 legami e quindi non ha altre coppie libere (tutti e 8 gli elettroni sono impiegati) ma appena l’H si è trasferito compare una coppia di elettroni, proveniente da un’ammina secondaria (base forte). In ambiente con acqua può prendersi il protone. Appena prende il protone la carica elettrica globale diventa di un’unità più positiva. Quindi ha un’affinità elettronica maggiore la seconda specie che ha una carica in più→arriva l’elettrone (da dove? Da NADH o altro).

Se si riduce da Fe²⁺ e Fe²⁺ si passa a Fe¹⁺ e Fe³⁺. Perché si riduce il Fe e non qualcos’altro?

• L’N ha 8 elettroni (4 legami) e quindi non può legare il 9° elettrone (l’affinità elettronica crolla)
• Il C ha 8 elettroni, non si può ridurre
• Solo gli atomi metallici (Fe) possono ridursi

Le proteine usano gli atomi metallici nelle catene di trasferimento elettronico→si ossidano e riducono facilmente, perché non hanno raggiunto l’ottetto. Se una molecola legata ad un catalizzatore si lega troppo fortemente, quella molecola diventa un inibitore. Il difficile di progettare catalizzatori è che reagente e prodotto non devono avere troppa affinità per il catalizzatore→appena H₂ si forma questo si deve staccare.

Perché il catalizzatore accelera le reazioni?

Perché abbassa l’energia di attivazione. Un catalizzatore rende più veloce sia la reazione diretta che quella inversa. Da cosa dipende il senso o l’altro? Dalla concentrazione→la concentrazione relativa sposta il ΔG della reazione, mentre la barriera viene abbassata in entrambi i sensi.

Se deve girare anche nell’altro senso, l’atomo di Fe deve avere affinità per H₂ altrimenti la razione non può andare in senso inverso. H₂ si stacca appena formatosi, ma l’H₂ come fa a legarsi a Fe?

[Legame chimico: condivisione di coppie elettroniche] Sull’H₂ non ci sono doppietti elettronici che si possono legare, ma il legame tra i 2 H₂ è di tipo sigma e tra i due atomi c’è una certa densità di elettroni, si è visto che si possono formare legami deboli ma non trascurabili tra le nuvole elettroniche sigma e gli ioni che hanno carica positiva. Non si forma alcun legame covalente ma gli elettroni che stanno in mezzo vengono attratti dalla carica del metallo, non c’è un vero legame chimico, ma una interazione elettrostatica. Per farlo è necessario però H₂ in concentrazioni sufficienti.

Per usare a livello industriale gli enzimi c’è un problema: si degradano a contatto con l’ossigeno molecolare e non catalizzano più. L’ossigeno è un fortissimo ossidante se si avvicina agli ioni di Fe¹⁺ e Fe²⁺ li ossida a Fe³⁺.

Il sito catalitico è nel core della proteina, nel mezzo. La macromolecola come caratteristiche deve avere:

• Sito catalitico
• Protoni che arrivano al sito catalitico
• Elettroni arrivano al sito catalitico
• Deve uscire H₂

Quindi servono 3 canali a livello del sito catalitico. I canali attraverso cui passano gli elettroni delle proteine devono avere ioni metallici uno dietro l’altro (non solo, può anche esserci NAD o FAD, ma servono ioni metallici nel caso delle idrogenasi). Il sito catalitico è collegato all’esterno da 4 cluster Fe-S. Questi cluster sono orientati uno dietro l’altro come un filo elettrico e gli elettroni possono fluire grazie alla capacità dei metalli di ossidarsi e ridursi.

Ma quali sono i limiti delle reazioni redox della cellula? La molecola più abbondante nella cellula è l’acqua. In una cellula posso far avvenire tutte le redox ma non ho un potenziale tale da far ossidare H₂O a ossigeno molecolare, perché se avessi delle redox che lavorano al potenziale che serve per ossidare l’acqua la cellula morirebbe.

Dall’altro lato se guardo il potenziale di riduzione di H⁺ ad H₂ si riduce l’acqua. Il solvente della cellula non deve reagire, se non in casi particolari. Il canale per far passare i protoni (particelle più piccole dopo gli elettroni) deve avere degli amminoacidi con caratteristiche di acido/base: ad esempio l’istidina ha l’anello imidazolico e ha un N con un doppietto elettronico libero e può cederlo ad un aa di fianco. L’alanina non va bene.

Quindi gli aa che vengono usati sono:

• Istidina
• Aspartato
• Glutammato
• Tirosina

E altri che dipendono dal contesto: la pKa della istidina è 6→a PH=6 metà istidine sono protonate e altre→deprotonata. Quindi se PH aumenta lega protoni ottimale per il canale. Ma l’H₂ e O₂ hanno dimensioni molto simili, quindi se c’è una galleria attraverso cui diffonde H₂ allora anche O₂ può diffondere. Ma in realtà O₂ è leggermente più grande perché ha più elettroni, quindi una delle sfide è di sostituire alcuni aa nel canale che congiunge il sito catalitico con l’esterno con aa leggermente più ingombranti, cioè cercare di restringere leggermente il canale→è una delle strategie ma è complicata perché devo sostituire aa naturali con aa diversi ma che devono essere non troppo più grandi altrimenti non passa più neanche H₂. Devo costruire una specie di setaccio molecolare.

Se voglio progettare una proteina con aa diversi da quelli che trovo in natura i problemi che si pongono sono: che amminoacidi sostituisco? Quali amminoacidi metto? Sicuramente non devono essere toccati amminoacidi conservati se voglio mantenere la funzione della proteina. Come fare a capire quali amminoacidi toccare? Si confrontano idrogenasi provenienti da specie diverse. Questo farà emergere che ci sono amminoacidi conservati. Se voglio fare ingegneria proteica quello che devo sapere è:

• La funzione della proteina
• La struttura della proteina

Quali sono i modi per reperire le informazioni? È necessario avere informazioni sulla struttura 3D perché altrimenti non posso fare nulla di razionale. La struttura 3D di una proteina è codificata dalla sequenza primaria della proteina→dipende dalla sequenza. La prima evidenza è stata ottenuta da esperimenti di denaturazione, che togliendo le condizioni di denaturazione la proteina torna spontaneamente allo stato nativo.