Struttura e Funzione dell'apparato Riproduttore - Appunti

TECNICHE DI MICROSCOPIA

La microscopia ottica

• Microscopio ottico a luce trasmessa
• Microscopio a fluorescenza

Allestimento di un preparato istologico

1. Prelievo
   • Fatto nel migliore dei modi
   • Devo sapere il tipo di indagine
     • Se devo studiare le proteine posso trasportare a T ambiente
     • Se devo studiare RNA devo immergerlo in fissativo a 0-4°C
   • Devo usare es. affettatrice e
     • a-traumatiche
     • traumatiche → con distill
   • Le campione deve avere dimensioni inferiori al cm³

2. FISSAZIONE

è fondamentale perché da questa deriva il resto

Lo scopo è di impedire la degradazione dei tessuti

Serve per mantenere il quadro strutturale inalterato

La fissazione va in base alla natura del tessuto ed al tipo di indagine

ALDEIDI

• Creano legami componenti tissutali (proteine, acidi nucleici)
• Fissativi progressivi
  • Più teniamo il campione, più si formano legami
  • No immunocito chimica, sì morfologica
• FORMALDEIDE 37%, si diluisce con PBS per cogliere 10-15% diluendola
  • No peribo detezione in situ
• PARAFORMALDEIDE 4% per RNA

MISCELE FISSATIVE

Zambron che decolora acidi nucleici

e inclusione dura 24h

lo xilolo è un AGENTE CHIARIFICANTE

• vede trasparente il campione /quindi

se il campione non è dissolto, non è disidratato bene

/quindi

tono indiretto agli alcoli per cercare di recuperare il campione anche se non gel fa bene

• 3 passaggi in xilolo per togliere alcoli la paraffina fissa - 3 passaggi

al terzo cambio di paraffina i campioni vengono messi in stufa sottovuoto per eliminare l'aria

/per avere una fissazione migliore

Il cell block

Unisce i vantaggi delle tecniche citologiche con quelli delle tecniche istologiche

Quando devo includere campioni molto piccoli (aghiata)

viene creato un involucro attorno al campione per trasportarlo all'interno delle soluzioni

così

anche se non vedo ciò che è nell'involucro.

*AGAR*

• Inerte = non reagisce con le altre sostanze
• Poroso = permette il passaggio dei liquidi facendoli arrivare al campione

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LE RESINE

a. EPOSSIDICHE

– DURCURAM ACM

• vanno bene per immunoistochimica
• se voglio ottenere una ultratittura pura
• sono idrofobe

per usarle devo disidratare e fissare bene

b. ACRILICHE

– LONDON RESIN WHITE (LRW)

• non sono fortemente idrofobe
• posso anche non usare il tetrossido di osmio
• polimerizza a 50°C
• non c’è denaturazine proteica e gli Ag non vengono alterate
• LRW viene diluito in H₂O percio devo usate queste resine per fare l’immunoistochimica

5. Colorazione

• a. Semifini
  • utilizzo di blù di toluidina
  • per osservazioni di M.O
• b. UltrafinI
  • si parla di contrastazione
  • metto acetato di uranile
  • per aumentare il numero atomico
  • del campione contrasto con citrato di piombo

IMMUNOISTOCHIMICA

- È una ricerca di proteine - Si utilizzano Ac diretti verso Ag

• DIRECTTO = Ac diretto contro Ag e coniugato con un marcatore
  • poco usata
• INDIRETTO = Ac I diretto contro Ag
  • Ac II diretto contro Ac I coniugato con un marcatore
  • metodo d’elezione

SISTEMA RIVELAZIONE

• ENZIMATICA
  • perossidasi e DAB
• con FLUOROCROMI

6. ANTICORPO PRIMARIO

• SPECIFICITA' = capacità dell'Ac 1 di riconoscere Ag anche dopo la fissazione
• SENSIBILITA' = capacità dell'Ac 1 di riconoscere quantità minime di Ag
  • dipende dalla fissazione
  • dall'incubazione
  • dalla natura dell'Ag
  • dalla qualità dell'Ac

9. CONTROLLI

l per assicurare il corretto corso dei tirocinati e la specificità della reazione

10. CONTROLLI DEI REAGENTI

• AC I
• con metodo I e I ma sierico o tampone
• RIVELAZIONE/AUTOFIUORESCENZA
• con metodo AC E II

b. CONTROLLO DEI CAMPIONI

• POSITIVO = campione che cospprime e fa
• NEGATIVO = campione che non ha fa diverso dal nostro
• INTERNO = campione dello stesso tipo già tentato per fa

NB se un ls valore bisogna usare sempre lo stesso!

POST-EMBEDDING

1. REPLEVIO
2. FISSAZIONE
   • L'uso dell'uso dei fissativi aldeidici
   • nessa post-fissazione si usa il^e TETROSSIDO DI OSMIO
   • ione
   • riduce il potere diffus^e
3. INCLUSIONE in RESINA
   • depo post-fissazion^e
   • EPOSSIDICA con la bone per analisi immunochimica
   • ACRILICA
   • protocollo LRW
4. TAGLIO
   • ultramicrotomo
   • raccolta delle sezioni vetrofini su retino di nick^e