Splicing eucarioti

SPLICING ALTERNATIVO

E’ un ulteriore meccanismo di splicing, definito alternativo perché ovviamente non avviene con

le stesse caratteristiche degli splicing di default, infatti questo tipo di splicing non va a

riconoscere i siti di splicing canonici a livello dei vari introni,ma va a riconoscere siti diversi

ovvero siti alternativi. Tuttavia potremmo pensare che visto che non si vanno a riconoscere i

corretti siti di splicing, questa modalità di splicing alternativa possa portare solamente alla

formazione di proteine non corrette, ma in realtà è stato visto che non sempre la selezione di

siti di splicing non canonici genera prodotti non utili, ma anzi nella maggior parte dei

casi,questa selezione di siti di splicing alternativi risulta essere un meccanismo di regolazione

dell’espressione genica,ovvero un meccanismo attraverso cui si possono generare prodotti

(proteine) alternative, partendo sempre da un trascritto unico. In particolare esistono diverse

modalità di splicing alternativi che possono portare a numerosi risultati:

-salto dell’esonesi verifica quando attraverso un meccanismo di splicing alternativo ad

esempio vengono riconosciuti solamente il confine 5’ dell’esone1 e il confine

3’ dell’esone 3, mentre tutto il resto,compreso l’esone2 viene riconosciuto

come sequenza intronica, per cui alla fine si metteranno assieme l’esone 1 e

l’esone 3, mentre l’esone 2verrà slittato fuori.

-esone esteso si verifica quando uno splicing alternativo, ad esempio porta a mettere assieme

l’intero esone 1 con solo una porzione dell’esone2. In particolare questo

succede perché all’interno dell’esone2(in questo caso),possiamo ritrovare uno

pseudo-sito di splicing (sito criptico) che mi può funzionare o da sito di splicing

al 3’, per cui il macchinario dello splicing al posto di riconoscere il corretto sito

di splicing al 3’

mi va a riconoscere questo pseudo sito di splicing, ovviamente alla fine avrò

messo assieme l’intero esone1 con solo una porzione dell’esone2.

-introne estesoavviene con le stesse modalità con cui avviene la formazione dell’esone

esteso, solo che qui lo pseudo sito di splicing non è presente all’interno

dell’esone,ma è presente all’interno dello stesso introne,per cui alla fine avrò

che,ad esempio l’esone 1 avrà legato un pezzettino di introne in più.

-introne mantenutoavviene quando uno splicing alternativo fa si che si mantenga alla fine un

introne o più introni all’interno del trascritto maturo.

-esoni alternativiavviene quando agisce uno splicing alternativo, che permette di mettere

assieme in maniera alternativa i vari esoni,quindi avrò esone1+esone2, oppure ancora

esone1+esone3 e cosi via.

Splicing alternativo =In particolare lo splicing alternativo può avvenire anche in maniera

Costitutivo COSTITUTIVA,ovvero attraverso un meccanismo che non avviene in

maniera regolata, ma che deve avvenire sempre e cmq,affinché possano essere

prodotte sempre determinate proteine.

Ad esempio il genoma del Virus SV40 della scimmia, codifica sempre per due antigeni che si

chiamano:

-antigene T(grande)

-antigene t(piccolo).

In particolare queste due proteine sono entrambe necessarie per la replicazione, per la

trascrizione, per l’oncogenesi e cosi via, ma purtroppo vengono codificate da un unico

gene, che quindi codifica per entrambi gli antigeni. Ovviamente affinché questo unico

gene possa codificare sempre per entrambi gli antigeni, deve avvenire un meccanismo di

splicing alternativo che avviene in maniera appunto costitutiva. In particolare succede

che all’interno del trascritto primario è presente un introne che funziona da codone di

stop (segnale di terminazione della traduzione), per cui avverrà un meccanismo di

splicing alternativo che mi manterrà all’interno di un m-Rna questo codone(viene

riconosciuto un sito di splicing al 5’ alternativo), mentre all’interno di un altro m-Rna

questo codone verrà eliminato (viene utilizzato un sito di splicing al 5’canonico), per cui a

livello del primo m-Rna la traduzione si arresterà prima, a livello del codone di stop (per

cui si traduce solo il primo esone), portando alla formazione di una proteine tronca che

corrisponde all’antigene t (piccolo), mentre nel secondo caso la traduzione continuerà

fino alla fine portando alla produzione di una proteina nomale (non tronca) che

corrisponderà all’antigene T(grande).

In particolare tutto questo avviene grazie alla presenza dei cosiddetti enhancer di

splicing, perché abbiamo detto che oltre alle ribonucleoproteine, sono presenti anche

altre proteine ricche in serina e arginina, che fanno avvenire tutte le interazioni e quindi

stabilizzano o meno la formazione dell’intero spliceosoma. In particolare succede che

l’enhancer di splicing SF2/ASF quando è presente ad alti livelli, spinge il macchinario

dello splicing verso l’utilizzo del sito di splicing al 5’ alternativo, perciò viene prodotto un

m-Rna per l’antigene t(piccolo), mentre se sono presenti bassi livelli di questo enhancer

allora succede che il macchinario dello splicing utilizzerà il normale sito di splicing al 5’,

per cui verrà prodotto un m-Rna per l’atingene T (grande).

Splicing alternativo = in particolare lo splicing alternativo può essere regolato da attivatori

e Regolato repressori,ovvero può essere regolato o in maniera positiva o in

maniera negativa. Ad esempio facciamo riferimento ad un

meccanismo di splicing alternativo che porta normalmente

all’espulsione di un introne dal trascritto primario, poichè a livello di

questo esone si va ad organizzare il macchinario di splicing. In

particolare vediamo che se a livello di questo introne si va a legare un

repressore, questo non permetterà l’assemblaggio dello spliceosoma,

per cui non avverrà splicing in maniera corretta. Quindi nel tipo

cellulare1 non viene prodotto il repressore e quindi avverrà lo splicing

alternativo normale,che permetterà l’espulsione dell’introne,mentre

nel tipo cellulare 2 verrà prodotto il repressore che non permetterà

che avvenga lo splicing normale. In particolare la stesa cosa succede

se utilizziamo gli attivatori,ovvero nel tipo cellulare1 non viene

prodotto l’attivatore,per cui non si potrà operare lo splicing

alternativo normale, perché il macchinario dello splicing da solo non è

in grado di andare a riconoscere l’introne,mentre nel tipo cellulare2

viene prodotto l’attivatore che aiuta il macchinario di splicing a

operare splicing alternativo normale, che quindi mi porta allo

slittamento di quell’introne.

☻In particolare esistono geni, che contengono numerosissimi siti si splicing alternativi, come

ad esempio il gene DSCAM di drosophila, che presenta a livello dell’esone 4 circa 12 possibili

siti di splicing,a livello dell’esone 6 presenta 48 alternative di splicing,a livello dell’esone 9

presenta 33 alternative di splicing, e ancora a livello dell’esone 17 presenta 2 alternative di

splicing,

che se fossero usate tutte, produrrebbe circa 38016 m-rna differenti e quindi altrettante

proteine. Tuttavia questo non può accadere,per cui ovviamente all’interno di questi geni

saranno presenti splicing alternativi preferenziali che verranno utilizzati in maniera

preferenziale. Infatti come nel caso della troponina T ά e β,che se vengono prodotte a

partire da un unico gene e quindi da un unico trascritto,attraverso un meccanismo di

splicing alternativo che mi permetterà da un lato di permettere di ottenere un m-Rna che

contiene l’esone1-esone2-esone3-esone5,che quindi mi porterà alla produzione della

troponina T ά,mentre dall’altro lato mi permetterà di ottenere un m-Rna che contenga

l’esone 1-esone2-esone4-esone5,che quindi porterà alla produzione della troponina T β.

Quindi visto che all’interno di questo geni sono presenti numerosi siti di splicing

alternativi, potremmo domandarci come fa il macchinario di splicing a poter identificare in

maniera alternativa, questi siti di splicing alternativi?

In realtà esistono due meccanismi diversi,attraverso cui il macchinario di splicing può

aumentare l’accuratezza della selezione di questi siti di splicing alternativi:

-Meccanismo 1sfrutta la selezione dei siti alternativi durante la trascrizione.

Ovvero noi sappiamo che all’Rna polimerasi II presenta una codina C-terminale che va

incontro a modifiche post-traduzionali di fosforilazione, a cui si agganciano numerose

proteine che vengono utilizzate per regolare la trascrizione, comprese le proteine SR,

che verranno cedute sul trascritto primario in modo che si vadano a posizionare a livello

dei siti di splicing 5’ che al sito di splicing al 3’ corretti, per cui in questo modo si riduce

di molto la possibilità di salti degli esoni. Quindi questo meccanismo di caricamento

avviene contemporaneamente alla trascrizione,infatti si parla di meccanismo co-

trascrizionale. Tuttavia può capitare che queste proteine al posto di andare a riconoscere

i siti di splicing primari,vengano cedute a siti criptici, per cui in questo modo avverrà

l’identificazione di siti di splicing alternativi.

-Meccanismo 2 questo secondo meccanismo sfrutta l’azione combinata delle proteine

SR che funzionano da enhancer di splicing e le cosiddette sequenze ESE (enhacers di

splicing esoniche).

In particolare le proteine SR si vanno a legare a queste sequenze ESE poste sul trascritto,

e da questa posizione vanno a fare interazioni con le componenti del macchinario di

splicing, reclutandoli nei siti di splicing vicini, per cui in questo modo il macchinario di

splicing si legherà in maniera più efficiente in questi siti di splicing segnalati dalle

proteine SR,che a livello di questi siti non corretti, ovvero a livello dei siti criptici posti

lontano dagli esoni. Fondamentalmente queste proteine Sr reclutano le proteine U2AFs al

sito di splicing al 3’ e la snRNP U1 a livello del sito di splicing al 5’.

SPLICING ALTERNATIVO IN DROSOPHILA

La determinazione del sesso in drosophila dipende da meccanismi di splicing alternativi,

che vengono innescati da un diverso rapporto tra cromosomi germinali (sessuali) e

cromosomi somatici, ovvero:

-la femmina presenta due cromosomi x, per cui avrà un rapporto alto pari a 1

-il maschio presenta un solo cromosoma x, per cui avrà un rapporto basso pari a 0,5.

Nei maschi avviene quello che viene chiamato splicing di default (basale-non regolato),

sesso specifico a livello del gene sexLetal, che mi porta alla produzione di una proteina

sexletal tronca.

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