Splicing eucarioti

Assemblaggio dello spliceosoma

Quando parliamo di spliceosoma, ci riferiamo sempre a un ciclo dello spliceosoma, perché tutte le particelle ribonucleoproteiche che partecipano alla formazione del complesso dello spliceosoma non vengono reclutate tutte contestualmente, ma vengono reclutate in maniera sequenziale, ovvero una dopo l'altra. Ecco perché diciamo che l'assemblaggio dello spliceosoma non si stabilizza se non si può procedere verso la tappa successiva.

Formazione del complesso early

In particolare, la prima tappa che si verifica nel ciclo dello spliceosoma deve necessariamente essere la formazione del:

• Complesso Early  è il primo complesso che si forma, in cui la ribonucleoproteina U1 va a fare interazioni con il messaggero, a livello del confine esone1/introne 5, ovvero va a riconoscere il sito di splicing al 5’(GU). Inoltre, sempre durante questa tappa, entrano in gioco altre due proteine: la proteina U2AF65 che legherà il segmento polypirimidinico, posizionato a valle del sito di ramificazione, in vicinanza dell’estremità 3’, e la proteina U2AF35 che riconoscerà e quindi legherà il sito di splicing al 3’, ovvero il confine introne3’/esone2. Tuttavia, entrambe queste proteine permetteranno il reclutamento di un’ulteriore proteina, cioè BBP branch point binding protein (SF1 nei mammiferi), che si andrà a legare a livello del sito di ramificazione, e da questa posizione sarà in grado di reclutare successivamente la proteina U2. In particolare, questo complesso corrisponde a quella che viene chiamata fase di commissionamento (commitment), poiché se non si formasse questo complesso iniziale, non si potrebbe procedere verso la formazione dello spliceosoma.

Formazione del complesso A

Tuttavia, una volta avvenuto ciò, si procede verso la tappa successiva che corrisponde alla formazione del:

• Complesso A  in questa tappa la proteina BBP, che risulta essere legata al sito di branch point, è capace di reclutare un’ulteriore proteina, ovvero la ribonucleoproteina U2, che a sua volta spiazzerà la proteina BBP, in modo tale che essa stessa possa appaiarsi al sito di ramificazione.

Formazione del complesso B

Una volta formato tutto questo, si procede verso la terza tappa che corrisponde alla formazione del:

• Complesso B  la formazione di questo complesso prevede fondamentalmente il coinvolgimento di altre particelle ribonucleoproteiche, ovvero U4, U5 e U6, che non vengono reclutate separatamente così come U1 e U2, ma vengono reclutate come un complesso proteico preformato, in cui tutte queste tre proteine interagiscono tra di loro. In particolare, l’arrivo di questo complesso proteico formato da U4, U5 e U6 provoca il rilascio delle proteine U2AF65 e U2AF35 che identificavano a loro volta il segmento polypirimidinico e il sito di splicing al 3’.

Rimodellamento dello spliceosoma

Tuttavia, una volta avvenuto il riconoscimento e il reclutamento di queste ulteriori particelle, lo spliceosoma deve andare incontro a un processo di:

• Rimodellamento  è un riarrangiamento interno dello spliceosoma che porta alla dissociazione di U4 da U6, che una volta liberata sarà capace di andare a spiazzare la ribonucleoproteina U1 dal sito di splicing al 5’, in maniera tale che essa stessa si possa legare al sito di splicing al 5’, cosa che non poteva fare fin quando rimaneva legato U4, poiché questo la sequestrava impedendogli di fare interazioni alternative, ovvero di operare questo spiazzamento di U1. Per cui in questo modo sia la proteina U4 che la proteina U1 verranno perse.

Formazione del complesso C

Tuttavia, questa prima fase del rimodellamento porta alla formazione del:

• Complesso C  arrivati a questo punto, la proteina U6, avendo una struttura secondaria e estremità a singolo filamento, da un lato avrà spiazzato e sostituito U1, poiché attraverso una sua estremità a singolo filamento si appaierà al sito di splicing al 5’, mentre dall’altro lato, sempre attraverso una estremità a singolo filamento, si assocerà con U2 che risulta essere legata al sito di ramificazione. Sarà proprio questo appaiamento tra le regioni a singolo filamento delle due ribonucleoproteine che porterà al misappaiamento dell’adenina presente a livello del sito di branch point, che quindi verrà spiazzata e di conseguenza attivata per andare a svolgere il proprio mestiere, ovvero quello di operare il primo attacco nucleofilo.

Meccanismo dell'attacco nucleofilo

In particolare succede che, proprio l’interazione tra queste due proteine U6 e U2, fa sì che il sito di ramificazione si avvicini al sito di splicing al 5’, per cui l’Adenina, utilizzando il suo 2’OH, che verrà prima deprotonato, va ad operare un attacco nucleofilo a livello della giunzione introne5’/esone3’, con conseguente rottura del legame fosfodiesterico tra il fosfato 5’ dell’introne e l’ossigeno 3’ dell’esone1, e il successivo trasferimento mediante la formazione di un legame estere, dell’estremità 5’ libera dell’introne sull’ossigeno 2’ della Adenina.

Tuttavia, una volta avvenuto il primo attacco nucleofilo, succede che U6 rimane legato all’esone1 al 5’, mentre la ribonucleoproteina U5 subisce un ulteriore riarrangiamento che fa sì che vengano avvicinati i siti di splicing al 5’ e al 3’, in modo tale che l’esone 1 con la sua estremità 3’O libera, sia in grado di andare ad operare la seconda reazione di trans-esterificazione, ovvero andrà ad operare un secondo attacco nucleofilo a livello della giunzione introne3’/esone5’, con conseguente rottura del legame fosfodiesterico tra l’ossigeno 3’ dell’introne e il fosfato 5’ dell’esone2, e quindi il successivo trasferimento attraverso un legame estere del fosfato 5’ dell’esone2 all’ossigeno 3’ dell’esone1. In definitiva, in questa seconda reazione, viene sostituito un legame fosfodiesterico tra l’introne e il secondo esone con un legame fosfodiesterico tra il primo esone e il secondo esone.

Quindi alla fine, dopo tutto questo processo, verrà rilasciato un introne sotto forma di cappio. In particolare, potremmo pensare che dopo la prima reazione di trans-esterificazione, l’esone1 possa essere libero di muoversi (nuotare), ma in realtà questo non succede, perché U5 in realtà non presenta regioni di complementarietà, ma si associa con l’ultimo nucleotide del primo esone e con il primo nucleotide del secondo esone, per cui non solo avvicina i due siti di splicing ma mantiene legato l’esone 1 e l’esone2, risultando quindi importantissimo per il posizionamento dei due esoni durante la seconda reazione di splicing.

Energia e splicing spliceosoma minoritario

In particolare, sia durante l’assemblaggio dello spliceosoma che durante i riarrangiamenti, c’è sempre una spesa energetica, data dall’idrolisi dell’ATP.

Splicing spliceosoma mediato minoritario  è un secondo tipo di splicing spliceosoma mediato, che avviene con le stesse caratteristiche di base dello spliceosoma maggioritario, ma a differenza di questo, lo spliceosoma minoritario non riconosce le giunzioni canoniche GU e AG, ma è capace di riconoscere introni che presentano ai loro confini (siti di splicing) AT al 5’ e AC al 3’.

In particolare, i meccanismi attuati da questa forma di spliceosoma minore si sovrappongono con quelli dello spliceosoma maggioritario, ovvero attuano gli stessi meccanismi, e anche le snRNPs sono generalmente omologhe tra i due tipi. Tuttavia, visto che i confini sono diversi tra i due tipi di splicing, è evidente che probabilmente, anzi sicuramente, le particelle ribonucleoproteiche utilizzate nella fase di commissionamento dovranno essere leggermente diverse, proprio perché dovranno riconoscere sequenze diverse. Infatti, è stato visto che sono presenti delle particelle chiamate U11 e U12 che fondamentalmente sostituiscono rispettivamente U1 e U2 nell’intero processo di splicing, ovvero U11 nel riconoscimento del sito di splicing al 5’, mentre U12 nel riconoscimento del sito di branch point. Quindi, in definitiva, vediamo che i meccanismi che avvengono in questo tipo di splicing spliceosoma mediato minoritario sono esattamente uguali a quelli che avvengono nello spliceosoma maggioritario, però è chiaro che si dovranno coinvolgere particelle ribonucleoproteiche diverse.