Spettroscopia

Introduzione alla chimica fisica

Prof. Marincola Chimica Fisica – Prof.sa Marincola 04 Ottobre 2012.

Il corso di chimica fisica verterà soprattutto verso l'impiego delle tecniche spettroscopiche in campo biologico. Oggi introduciamo solamente questi concetti, per cui si parlerà di spettro elettromagnetico, di radiazione elettromagnetica, di modello classico e quantistico.

Punto di partenza e ruolo del biologo molecolare

Qual è il punto di partenza? Cosa fa un biologo molecolare? Prendiamo l'esempio del DNA, si sa come è fatto, si sa da cosa è composto, si sa che struttura ha, si conosce il funzionamento, la replicazione, con chi interagisce; tutte cose che aiutano a capire come funziona una cellula, un organismo, però all'atto pratico questo modo di operare del DNA è vero solo perché il DNA ha una certa struttura. Infatti, se il DNA non fosse una doppia elica ma fosse un triangolo o avesse la forma di un pentagono probabilmente non potrebbe svolgere quelle sue funzioni.

Il bromuro d'etidio (agente mutageno – cancerogeno) ha un modo particolare d'interagire con il DNA, infatti appartiene alla categoria degli intercalanti: entra dentro la doppia elica e si intercala tra le base portando ad una modificazione strutturale: a questo punto il DNA non è più funzionante. Quindi ciò che si studia funziona in un determinato modo e con determinati meccanismi proprio perché ha una struttura particolare.

Diversità strutturale del DNA

Vediamo la figura del b-DNA, ovvero nella sua struttura fisiologica. Ma il DNA non ha solo questa struttura poiché esiste anche l'a-DNA e lo z-DNA che hanno strutture diverse e funzioni diverse, ed il fatto che solo il b-DNA venga ritrovato nella condizione fisiologica ha un certo significato. E quando il b-DNA intercala una molecola? Allora ne viene modificata la struttura.

Metodi di studio delle molecole

Tutte le nozioni che avete accumulato durante il vostro percorsi di studi, come sono state ottenute? Esiste una macchina fotografica che abbia permesso di fare fotografie di questo tipo? Esistono videocamere che abbiano permesso di entrare a vedere cosa succede al DNA nel nucleo della cellula? Assolutamente no. Le informazioni sono state ricavate dallo scienziato utilizzando delle tecniche analitiche. Tra queste, le tecniche spettroscopiche rivestono un'importanza notevole per dare informazioni su quella che è la struttura e la reattività delle molecole.

Si tratta sempre di tecniche che danno delle informazioni indirette, nel senso che non si vede magari il DNA in quanto tale ma si va a monitorare una sua proprietà, che si sa essere legata alla struttura del DNA, per cui cambiando quella proprietà, a seconda delle condizioni sperimentali, possono essere fatte delle ipotesi che poi andranno confermate con altre tecniche. Per cui mettendo insieme tutte queste informazioni, si arriva a poter fare delle animazioni che effettivamente rappresentano quello che succede nel nostro organismo a livello molecolare.

Spettroscopia e radiazione elettromagnetica

La spettroscopia in generale è una disciplina che studia l'interazione tra le radiazioni elettromagnetiche e la materia. Che cos'è una radiazione elettromagnetica? Tutte le radiazioni elettromagnetiche sono contenute nel cosiddetto spettro elettromagnetico: raggi gamma, raggi x, microonde, radiofrequenze, infrarosso, UV. Con alcune conviviamo costantemente, con altre, fortunatamente, solo in alcune occasioni. Esiste una porzione del visibile che è l'unica nei confronti della quale l'occhio umano risulta essere sensibile; tutte le altre non le vediamo però possiamo percepirne l'esistenza.

In realtà quando andiamo a parlare di radiazione elettromagnetica e di interazione con la materia non dobbiamo pensare a qualcosa di assurdo, perché effettivamente, siamo in grado di sperimentare che la radiazione elettromagnetica sta interagendo con la materia: fenomeni fisici come la riflessione o la rifrazione, sono frutto dell'interazione fra la luce e la materia.

Fenomeni fisici e interazione luce-materia

Nel caso della riflessione, la luce incidente sulla superficie dell'acqua risulta essere riflessa secondo un'angolazione che risulta essere uguale nei due casi rispetto alla normale del piano: un fenomeno fisico. Stessa cosa avviene nel caso della rifrazione: in questo caso la luce viene trasmessa attraverso due messi diversi, aria e acqua. Si tratta di fenomeni fisici che avvengono nel campo macroscopico.

Interazione della radiazione nel microscopico

Nel microscopico però le cose cambiano. Fondamentalmente la presenza di un fenomeno non esclude che se ne verifichino altri, nel senso che se voi avete un oggetto, qualunque esso sia, e irradiate l'oggetto con una luce incidente, voi potete avere più fenomeni contemporaneamente: la radiazione può essere riflessa, trasmessa, diffusa. Questi fenomeni possono avvenire contemporaneamente o selettivamente a seconda delle proprietà della materia dell'oggetto. La radiazione può anche essere assorbita dalla materia e in alcuni casi riemessa: fluorescenza e fosforescenza sono classici esempi di emissione di radiazione elettromagnetica.

Spettro elettromagnetico

Fondamentalmente, quante sono le radiazioni con cui possiamo avere a che fare? Questa è una rappresentazione schematica di quello che è lo spettro elettromagnetico. Le radiazioni sono indicate con il loro nome comune, partendo da destra verso sinistra: raggi gamma, raggi x, UV, infrarosso, microonde e onde radio. L'ordine con cui sono riportate non è casuale, ma dipende dall'energia della radiazione (dalla più alta energia alla più bassa): la radiazione elettromagnetica è fondamentalmente energia che si propaga nello spazio. Nella stessa direzione dell'energia si sposta la frequenza, mentre la lunghezza d'onda si sposta in direzione opposta.

Interazioni radiazione-materia

Quello che vi voglio far notare è che, proprio perché hanno energia diversa, queste radiazioni possono interagire con la materia in maniera diversa. Per esempio, un medico non vi dirà mai di fare due radiografie a tempi ravvicinati perché i raggi x ionizzano la materia portando alla formazione di specie radicale che andrebbero ad danneggiare l'organismo. Invece la risonanza magnetica utilizza onde radio, che hanno un bagaglio energetico talmente basso da non interferire con quella che potrebbe essere lo stato di salute dell'individuo.

Spettro visibile

L'unica porzione dello spettro elettromagnetico visibile per l'occhio umano è la regione della luce visibile, che vedete come un arcobaleno; questo perché il fenomeno fisico che da luogo all'arcobaleno non è altro che un fenomeno di dispersione e diffrazione della luce da parte delle goccioline d'acqua, che scompongono la luce in quelle che sono le sue componenti. Si tratta di radiazioni elettromagnetiche che nel particolare vanno da una lunghezza d'onda di 400nm a 700nm.

Lo stesso effetto lo potete osservare utilizzando un prisma che ha la capacità di scomporre la luce nelle sue componenti.

Modello classico e quantistico

Per poter spiegare tutti questi fenomeni è necessario ricorrere ad un modello come in tutti i casi in cui si presenta la necessità di descrivere un fenomeno fisico di questo tipo. L'unico modello esistente fino ai primi anni del '900 è il cosiddetto modello classico, che descrive la radiazione elettromagnetica come un'onda sinusoidale (è esattamente uguale ad un'onda acustica), che ha una componente elettrica ed una componente magnetica espresse attraverso delle grandezze vettoriali, le due componenti sono normali l'una rispetto all'altra, e che si propaga in una direzione che è ortogonale a quella d'uscita.

Caratteristiche delle onde

Quali sono le caratteristiche di queste onde? Si distinguono per lunghezza d'onda, per frequenza, per energia, hanno anche una velocità di propagazione e per intensità. Che cosa ci rappresenta la lunghezza d'onda di una radiazione elettromagnetica? Essa è la distanza tra due punti di massimo, ma essendo l'onda simmetrica potremmo anche dire che è la distanza tra due punti di minimo.

L'unità di misura della lunghezza d'onda è il metro, ma ovviamente utilizziamo dei sottomultipli per cui stiamo andando a valutare radiazioni che hanno una lunghezza d'onda fondamentalmente intorno ai nanometri, picometri e così via, oppure si utilizza l'ångström che corrisponde a 10^-10 metri.

Per cui quando voi andate a parlare di luce come componenti, state facendo riferimento a delle radiazioni che, hanno sì un colore diverso, ma in termini di lunghezza d'onda hanno una proprietà differente, passando dalla luce rossa a quella viola si ha un accorciamento della lunghezza d'onda (dai 600 ai 400 nm), che in maniera grafica possiamo immaginare come una riduzione della distanza tra i due punti di massimo. Il parametro inversamente correlato alla lunghezza d'onda è la frequenza, che ha come unità di misura l'Hertz, e che rappresenta il numero di cicli compiuti per secondo.

Relazione tra lunghezza d'onda, frequenza ed energia

Immaginando che questa sia un'istantanea di tre reazioni, chi compie più cicli è la radiazione viola che avrà una lunghezza d'onda più corta ma una frequenza più alta. Questa costante di proporzionalità di lunghezza d'onda e frequenza è data dalla velocità della luce. L'ultimo parametro è l'energia. Vi ho detto che le radiazioni elettromagnetiche hanno energia e questa dipende dalla frequenza; la costante di proporzionalità, indicata con “h”, è la costante di Planck. Occhio a non scambiare l'energia con l'intensità, perché l'energia è pari ad “hv”, ma la quantità di energia per unità di tempo e superficie è l'intensità della radiazione elettromagnetica. Praticamente, l'ampiezza dell'onda rappresenta l'intensità della radiazione elettromagnetica.

La nascita del modello quantistico

Agli inizi del '900 si verificarono sperimentalmente dei fenomeni che non potevano essere spiegati con il modello classico. In primis il fatto che la materia irradiata con radiazioni elettromagnetica elimina elettroni. Oppure che la materia irradiata con radiazione elettromagnetica emette radiazione elettromagnetica. Allora, una situazione del genere non poteva più essere spiegata dal modello classico perché non c'erano le basi, innanzitutto per spiegare come la materia potesse emettere queste onde e poi come un'onda di per se potesse da sola favorire l'espulsione di un elettrone. Non esisteva quindi una spiegazione matematica che potesse sostenere un dato sperimentale di questo tipo.

Einstein fu uno dei primi che introdusse un concetto nuovo: la radiazione, in realtà, può essere vista come un'onda, però può essere concepita anche come pacchetto di particelle, che prendono il nome di fotoni. Allora, il fotone continua ad avere la sua energia e in realtà ha la caratteristica di avere in parte proprietà di un'onda, perché il concetto di lunghezza d'onda e frequenza rimane, ma in parte ha anche proprietà di materia.

Natura ondulatoria e corpuscolare della luce

Inquadrando la radiazione elettromagnetica come particelle d'energia, ecco che se queste particelle di energia entrano a contatto con la materia e scambiano questa energia con gli elettroni, saranno le stesse particelle a favorirne l'espulsione, a patto che siano determinate condizioni della materia. Quindi, la luce, oltre ad avere una natura ondulatoria, ha anche una natura corpuscolare. Questi concetti mettono le basi per la meccanica quantistica, il concetto di fotone inteso come quanti di luce e per cui al modello classico si affianca il modello corpuscolare.

Vale sempre il principio che la radiazione elettromagnetica è una forma di energia che si propaga nello spazio, però ha delle proprietà corpuscolari in quanti è formato da particelle che continuano ad avere un'energia pari ad “hi”.

Intensità e numero di fotoni

Fermo restando tutte queste cose uno potrebbe dire: si va bene, capisco l'energia, ma l'intensità che mi avevi spiegato come ampiezza di onda elettromagnetica che cosa è? Questa volta, l'intensità dipende dal numero di fotoni che vanno a comporre la radiazione elettromagnetica, chiaramente nell'unità di tempo. I concetti rimangono, però devono essere adattati in modo diverso. Solo così è stato possibile spiegare fenomeni come la fluorescenza e la fosforescenza, come l'assorbimento di radiazioni uv-visibili.

Esempio pratico: assorbimento della caffeina

Nell'esperienza di laboratorio di chimica era stato misurato l'assorbimento specifico della molecola della caffeina: si misura l'assorbanza per sapere quanta caffeina è stata estratta. Quindi si utilizza una radiazione elettromagnetica, in questo caso quella della porzione uv-visibile, è stata fatta assorbire al campione e si è sfruttato tutto ciò per dire quanta resa si era ottenuta dall'estrazione della caffeina.

Interazione radiazione elettromagnetica e materia

Alla base dell'interazione tra radiazione elettromagnetica e materia c'è uno scambio di energia. Però uno dice: si ha un'energia diversa nei diversi casi di onde elettromagnetiche; a questo punto la molecola che fa? Si comporta sempre nello stesso modo? No, perché anche le molecole hanno energia. Anche noi abbiamo energia: cinetica e potenziale. Quindi anche le molecole hanno la loro energia: si muovono, con movimenti di rotazione, vibrazione, traslazione, per cui hanno energia rotazione, vibrazionale, traslazionale. E gli elettroni dentro le molecole? Vediamo gli orbitali atomici: gli elettroni presenti nei diversi orbitali hanno diversa energia, quindi gli atomi hanno diverse energie elettroniche.

Energia e stati molecolari

Ritorniamo alle molecole: possiamo avere energie elettroniche diverse tenendo in considerazione non più gli orbitali atomici ma gli orbitali molecolari. Però, come si formano i legami? Come si forma, per esempio, il legame tra due atomi di idrogeno? La configurazione elettronica dell'idrogeno è 1s, quindi ha un orbitale 1s che sovrapposto con l'orbitale 1s dell'altro, forma un orbitale molecolare sigma che contiene due elettroni.

Una molecola ha quindi un'energia rotazionale, traslazionale, vibrazionale, elettronica (degli elettroni di non legame e di valenza), diversi tipi di energia nucleare. Per cui la materia è energia e la radiazione è energia. Sono energie che hanno forme diverse, ma sono energia. Per cui due energie di questo tipo che vengono a contatto tra di loro possono interagire scambiandosi l'energia. Queste energie ovviamente non sono tutte uguali, per esempio un'energia rotazionale è come ordine di valenza più bassa di quella vibrazionale che è più bassa di quella elettronica.

Interazione specifica con stati energetici

A seconda della radiazione utilizzata, si può interagire in maniera specifica solo con alcuni stati energetici. Se io voglio cambiare la configurazione elettronica di una molecola devo usare radiazioni uv-visibili; quando avete fatto la misura sulla caffeina, senza saperlo, ne avete promosso uno stato elettronico eccitato che ha portato al risultato numerico che è una misura di assorbanza, ma avete usato le radiazioni in uv-visibile.

Se io voglio modificare gli stati rotazionali delle molecole uso le radiazioni microonde: nel fornetto a microonde si mette un cibo, che deve essere umido, le radiazioni agiscono sull'acqua dell'elemento e alterano gli stati rotazionali dell'acqua, le molecole iniziano a muoversi, si riscaldano ed aumentano la temperatura del cibo. Se voglio invece avere a che fare con gli stati vibrazionali si utilizzano solo le radiazioni infrarosse. A seconda delle radiazioni che si utilizzano, possono essere ottenute tante informazioni sulla molecola in esame.

Studio della molecola tramite spettroscopia

ESEMPIO: supponiamo che stiamo analizzando la parola “molecola”. Attraverso la radiazione uv-visibile è possibile capire se si tratta di un aggettivo, di un sostantivo, un pronome o altro: quindi si capirà che tipo di molecola si ha (satura, insatura, ecc).

Se volete avere informazioni un po' più precise su quella che è la composizione della molecola, quindi in questo esempio diremmo che vogliamo sapere quali lettere vanno a formare la parola, allora dovremmo usare le radiazioni IR perché permettono di capire quali sono i gruppi funzionali della molecola: capirete se è un chetone, se è un'aldeide, se è un acido carbossilico.

Se addirittura volete capire la struttura della molecola, per cui nella vostra parola capire quale lettera viene una dopo l'altra, per cui capire se vicino ad un CO c'è un CH₂ o un doppio legame ecc, ricorrete ad una tecnica che fa uso delle onde radio e si chiama spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR).

Conclusioni sull'interazione radiazione molecolare

Tutte queste tecniche spettroscopiche vi permettono di studiare da diversi punti di vista il vostro sistema molecolare ed otterrete le informazioni che si complementano aiutandovi a formare il quadro particolare della molecola.

Vi chiederete: devo utilizzare tutte queste tecniche? Dipende dallo scopo e dagli strumenti che uno ha in laboratorio.

Livelli energetici e radiazione

Per capire esattamente che cosa avviene a livello microscopico nel vostro sistema quando interviene una radiazione elettromagnetica, dobbiamo ragionare in termini di livelli energetici. Quelli rappresentati in rosso sono i livelli energetici fondamentali della molecola, per cui sono gli equivalenti degli orbitali atomici ma sono orbitali molecolari. Le molecole, a differenza degli atomi, possono vibrare e ruotare. Quindi dovremmo tenere conto che oltre ai livelli elettronici diversi, esistono dei livelli, di minore energia in termini di gap (di distanza), che sono quelli vibrazionali e rotazionali.

Tutte le volte che la radiazione elettromagnetica interagisce con la materia, se la radiazione ha un'energia uguale al gap energetico tra due livelli si ha un'eccitazione. L'assorbimento letto con la spettroscopia uv-visibile con la caffeina è un assorbimento alla lunghezza d'onda di 560nm. Perché, se potevate andare dai 20 ai 700 nm, è stata scelta proprio quella lunghezza d'onda? Perché il salto energetico che ha luogo all'interno della caffeina, coinvolge un gap che ha un val...