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Sistematica proteine, Biochimica

Appunti della lezione del professor Alberto Boffi per il suo esame di Biochimica. Gli argomenti che vengono trattati nel documento sono i seguenti: la sistematica delle proteine e degli enzimi, la proteasi, i principi di interazione tra proteine e acidi nucleici.

Esame di Biochimica docente Prof. A. Boffi

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Sistematica di enzimi e proteine

Proteasi

Enzimi importantissimi che appartengono alla classe delle idrolasi, sono capaci di catalizzare una

scissione idrolitica del legame peptidico. Importanti nella maturazione delle proteine negli eucarioti,

servono sempre proteasi; in tutti i meccanismi della morte cellulare programmata; nei meccanismi

della coagulazione per la quale interviene una cascata di proteasi; proteasi digestive; sono

presenti anche le proteasi virali, tra i bersagli preferiti delle terapie antivirali perché i virus si

replicano producendo poliproteine che devono essere tagliate da proteasi virali per diventare

attive.

Sono enzimi che si sono evoluti per tagliare legami peptidici in maniera specifica, ci sono proteasi

che riconoscono sequenze peptidiche discrete (un po' come le nucleasi) e tagliano solo in

presenza di quella sequenza polipeptidica; altre proteasi tagliano un po' tutti i legami; ci sono delle

proteasi di posizione, la carbossipeptidasi, taglia le proteine solo a partire dal loro C-terminale,

tagliando un peptide alla volta (corrispettivo nucleasico della carbossipeptidasi sono le

esonucleasi, tagliano da una estremità del dna).

Le proteasi hanno alcuni aspetti in comune, devono avere un sito attivo particolare adatto a legare

un intero peptide o una proteina, servirà un sito attivo dotato di una certa plasticità, possono

riconoscere un legame peptidico specifico ma che può essere presente in più proteine, quindi

necessitano di una plasticità, adattando la loro specificità di substrato a proteine diverse. Se il

legame peptidico che una proteasi deve aggredire si trova all'interno della proteina substrato, la

proteasi non lo taglia. Tutte le proteasi legano il substrato attraverso interazioni non covalenti,

legami idrogeno, interazioni elettrostatiche, interazioni idrofobiche; riescono a formare quindi un

complesso enzima substrato non covalente. possono anche formare un complesso enzima

prodotto. L'equazione di Michaelis-Menten sarà in questo caso E+S=ES=EP=E+P. Rispetto alla

classica cinetica, le proteasi aggiungono un passaggio in più. La caratteristica è che il complesso

enzima-prodotto è un complesso covalente che fa sì che l'equazione di Michaelis-Menten sia

descrivibile a quattro termini. La cinetica non varia nella rappresentazione dell'equazione, poiché,

essendo un'equazione lineare, non ramificata, anche aggiungendo un passaggio all'interno dello

schema di reazione, si osserverà lo stesso svolgimento, si può determinare Km e Vmax anche per

le proteasi; per ricavarla sarà necessario integrare il complesso es e il complesso ep, il ché ha

delle limitazioni in quanto il complesso ep si forma con reazione irreversibile; tuttavia con buona

approssimazione si può ricondurre correttamente alla cinetica di Michaelis-Menten.

Analizziamo una sottoclasse delle proteasi, le proteasi a serina: tripsina, chimotripsina, elastasi

(proteasi digestive); trombina, tpa, plasmina (proteasi della cascata della coagulazione); subtilisina

(proteasi che riconosce quasi tutti i legami peptidici e ha una Km molto bassa, efficienza catalitica

molto elevata, è prodotta dal bacillus subtilis). Tutte queste proteasi hanno una serina nel loro sito

catalitico: la serina fa parte della cosiddetta triade catalitica, comprende tre amminoacidi, serina,

istidina e acido aspartico. In una combinazione particolare, questi tre amminoacidi costituiscono

un'efficiente sito attivo per la catalisi dell'idrolisi del legame peptidico in tutte le proteasi a serina.

Sono in parte omologhe, hanno somiglianze nella struttura, anche se i residui di serina, istidina e

aspartato sono situati in maniere diverse, spesso poste sempre nello stesso sito, His 57, Asp 102,

Ser 195, cioè all'allineamento delle sequenze si allineano sulla triade catalitica e si numerano coi

residui.

Le proteasi a serina digestive sono tre: tripsina, chimotripsina e elastasi, prodotte nelle cellule

acinose del pancreas, dunque fanno parte della secrezione esocrina del pancreas; vengono

prodotte e secrete come precursori inattivi (proteina secreta ma non attiva, importante perché se

fossero attive verrebbero a digerire la cellula, nel coledoco digerirebbero la parete), sono fatte in

maniera da attivarsi nel duodeno. L'attivazione dipende da un cambiamento del pH, nel duodeno

lievemente acido, in contrapposizione al succo pancreatico basico, ricco di bicarbonato; quindi

abbassamento del pH e legame di ioni calcio determinano l'attivazione. Chimotripsinogeno,

tripsinogeno e elastasi sono i precursori di chimotripsina, tripsina ed elastasi: sono proteine più

lunghe delle proteine attive che nella regione N-terminale vengono tagliate, si idrolizzano tra di

loro, cioè nella regione N-terminale è presente una sequenza polipeptidica che normalmente

ostruisce il sito attivo, ma viene liberata attraverso l'attivazione delle altre proteine (si autoattivano

l'una con l'altra). Nel duodeno operano la loro azione digestiva degradando le proteine in peptidi

più piccoli.

Queste proteasi sono molto simili, non appartengono solo alla stessa sottoclasse, ma anche alla

stessa famiglia. Sono formate da due domini, tenuti insieme da regioni disordinate. I due domini

sono uno un accenno di beta-barrel e un pavimento beta, contornati da strutture ad alfa elica,

struttura a dominio piuttosto complessa che identifica bene due lobi. la triade catalitica si trova

nello spazio fra i due lobi. Di fatto la chimotripsina rappresenta un "mascella e

mandibola", i due domini sono fatti in maniera da possedere una zona interna

che separa i due domini piuttosto flessibile e in mezzo la triade catalitica Ser,

His, Asp. Una proteasi potrà funzionare con due lobi mobili che si aprono e

si chiudono, cerca sulla sequenza proteica il peptide da idrolizzare, lo aggancia

e lo idrolizza (funzionamento di tutte le proteasi). L'enzima a riposo

contiene i tre residui di Asp, His e Ser [fra questi amminoacidi si disegnano due

-

protoni condivisi, a pH basico o neutro l'Asp sarà COO , l'His sarà

protonata/deprotonata al 50% la Ser sempre protonata; il segreto è quello di coordinare i due

protoni fra questi amminoacidi] si crea una rete di legami idrogeno tra Asp, primo azoto dell'His,

secondo azoto dellìHis e Ser. Lo scopo è quello di rendere la Ser il più nucleofila possibile. L'alcol

è già un discreto nucleofilo, un alcol deprotonato (un alcossido) sarà un potente nucleofilo; qui il

protone viene attratto dall'N dell'His e dall'Asp, i protoni tenderanno ad essere attratti da questi

amminoacidi, conferendo alla Ser un forte carattere nucleofilo con parziale carica negativa.

Ovviamente lo scopo sarà effettuare attacco nucleofilo sul carbonile del legame peptidico. Il

problema è che il carbonio carbonilico del legame peptidico è un elettrofilo meno forte di un estere,

quindi per attaccarlo servirà un nucleofilo molto forte, l'ossidrile della serina.

[R1-CO-NH-R2 il legame tra serina e carbonio carbonilico si forma il legame tra serina e carbonio

carbonilico e si rompe il legame del carbonio carbonilico, e si forma l'intermedio tetraedrico; si

idrolizza il legame peptidico, si riforma il doppio legame e l'unico protone disponibile viene

prelevato dal gruppo amminico; si verrà a formare un estere con la catena polipeptidica

precedente al legame peptidico R1, mentre fuoriesce dal substrato il peptide idrolizzato a partire

dall'N-terminale della catena R2; a questo punto si forma un complesso covalente tra la catena R1

e la proteasi a serina (come previsto dallo schema), ovvero la formazione di un estere tra la catena

polipeptidica tagliata e l'OH della Ser, complesso Acil-enzima, il complesso ep, perché è un estere

di un amminoacido del C-terminale di una catena polipeptidica; una parte del prodotto è già uscita,

ma la parte più importante resta legata all'enzima. Il complesso Acil-enzima avrà una struttura

particolare, i protoni si sono ben stabiliti uno sull'His e uno sull'Asp, non può andare sulla serina

perché l'ossigeno bivalente della Ser è già impegnato sui due legami; in questo modo i due protoni

sono spostati su His e Asp, il protone legato al gruppo amminico, proveniente dall'acqua, genera

un potente nucleofilo, l'OH-, per far uscire il gruppo amminico; il gruppo OH- compirà attacco

nucleofilo sul carbonio carbonilico, si rompe il doppio legame, si forma l'intermedio tetraedrico,

dopodiché formato il legame con l'OH si rompe il legame C-Ser e si riforma il doppio legame e

l'altro peptide viene liberato dall'enzima sotto forma di peptide C-terminale; a questo punto i due

protoni della triade catalitica si rispostano verso destra, l'O- della serina non può rimanere così.

Questo è il meccanismo di scissione del legame peptidico].

Rivediamo le tappe fondamentali:

1- attacco nucleofilo dell'ossidrile della serina sul carbonio carbonilico;

2- formazione dell'estere fra la serina e il C-terminale del peptide idrolizzato e formazione del

complesso Acil-enzima;

3- intervento di una molecola d'acqua, un OH-, per catalizzare l'idrolisi del complesso Acil-enzima.

L'enzima è quindi stato rigenerato e potrà effettuare un nuovo ciclo catalitico. Così funzionano le

proteasi, generano quindi un nucleofilo abbastanza forte da intaccare il legame peptidico. Le


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DETTAGLI
Esame: Biochimica
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (a ciclo unico)
SSD:
A.A.: 2015-2016

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher eugcamp93 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biochimica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università La Sapienza - Uniroma1 o del prof Boffi Alberto.

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