Sistematica proteine, Biochimica

Vediamo l'insieme delle proteasi digestive. non ci sono solo proteasi a serina, ci sono anche

proteasi a carbossile, le carbossipeptidasi che invece idrolizzano la proteina a partire dal

carbossiterminale (NON sono proteasi a serina). Perché ci sono tre proteine diverse? Tutti questi

enzimi hanno una specificità di substrato, non tagliano qualsiasi legame peptidico. La tripsina

taglia tutti i legami peptidici preceduti da una lisina: vicino al sito attivo è presente una cavità che

ospita la catena laterale dell'amminoacido precedente al legame peptidico che deve essere

tagliato. La lisina si piazza nella cavità esponendo il legame peptidico al sito attivo, viene tagliato

se sul carbonio alfa di R1 è presente una lisina. La chimotripsina invece lavora con una

fenilalanina, ci sarà una cavità nel caso idrofobica che ospita un fenile di una fenilalanina; queste

cavità saranno disegnate dalla catene dell'enzima stesso, in questo caso amminoacidi idrofobici,

nel caso della tripsina ci sarà un aspartato che lega la lisina. L'elastasi riconosce invece

specificamente l'alanina; è infatti una proteina ricca di piccoli amminoacidi, in particolare alanine,

quindi l'elastasi si è evoluta per tagliare proteine ricche in alanina. La carbossipeptidasi non a

serina riconosce il carbossiterminale qualsiasi esso sia e taglia il legame peptidico precedente al

carbossiterminale.

Principi dell'interazione fra proteine e acidi nucleici

Fa parte del capitolo di riconoscimento delle macromolecole, come nel caso della proteasi,

riconoscimento proteina-proteina, le proteasi riconoscono una catena polipeptidica o nel caso

specifico un amminoacido. Nell'interazione acidi nucleici-proteine la situazione è simile, però si

veste di una certa complessità. Ad esempio le nucleasi di restrizione riconoscono delle sequenze

specifiche. Come fanno? Ad esempio tutti i fattori di trascrizione, gli attivatori, fattori che agiscono

col dna. Queste proteine devono riconoscere la sequenza di basi sulla doppia elica. Le strutture

più comuni, dna di tipo b, con un solco maggiore e un solco minore, solchi determinati dalla catena

di polifosfati; dna di tipo a, in cui i solchi sono equispaziati, dna telomerico; dna supercompattato, o

tipo z, esiste solo un solco, il solco maggiore, però nella maggior parte dei casi il dna più frequente

è quello di tipo b, con un solco maggiore e un solco minore. Un fattore di trascrizione che

riconosce una sequenza di dna ha a disposizione solco maggiore e solco minore; le basi azotate

sono accoppiate da legami idrogeno, due fra A e T e tre fra C e G. Nei solchi si affacciano i margini

laterali delle coppie di basi, ci saranno degli atomi che sono al di sopra o al di sotto che sono

visibili sul solco maggiore o sul solco minore. Sono questi atomi che le proteine riconoscono.

Sono quattro situazioni possibili A-T T-A C-G G-C. Una volta accoppiate, si identificano gli atomi

del solco maggiore (W1 W2 W2' W1', wild); nella coppia G-C vedremmo l'N7, l'O6 della guanina e

della citosina l'H4 dell'NH amminico e il protone del C5 (sul solco maggiore ci saranno quattro

atomi della coppia GC, nella coppia CG si vedranno gli stessi atomi al contrario); nella coppia AT si

vedranno l'N7, l'NH dell'adenina, della timina l'O4 e il metile in 5. AT o TA, CG o GC vengono

riconosciuti tramite questi quattro atomi. Queste distribuzioni di atomi danno origine ad un codice

di riconoscimento, mediante il quale tutte le proteine che riconoscono il DNA in maniera sequenza

specifica adottano questo codice di riconoscimento.

Questo codice sarà formato da: atomi accettori di legame idrogeno [in rosso], atomi donatori di

legami idrogeno [in azzurro], atomo di idrogeno [in bianco] legato al carbonio, quello della citosina

in C5, il gruppo metilico [in giallo] in posizione 5 della T. L'azoto con il doppietto elettronico in

posizione 7 delle basi puriniche è un accettore di legame idrogeno, l'NH della citosina è un

donatore di legame idrogeno; l'O nella G è un accettore di legame idrogeno. Le basi azotate oltre

ad avere i legami idrogeno che permettono di riconoscere una base con quella complementare,

hanno disponibili altri atomi per formare legami idrogeno o interazioni idrofobiche col gruppo

metilico come quello della timina in 5. Nasce quindi un codice in forma di matrice 4x4: nella coppia

GC abbiamo 2 accettori di legame idrogeno, un donatore e un idrogeno legato al carbonio, un CH

(gli H legati al carbonio non sono generalmente dei donatori di legami idrogeno); nella coppia AT ci

saranno un accettore, un donatore, un accettore e un metile; la GC sarà uguale alla CG letta al

contrario, come AT per TA. Quindi una matrice 4x4 che identifica il codice di riferimento che è

possibile leggere sul solco maggiore del dna. Anche il solco minore ha un suo codice di lettura, con

solo tre amminoacidi, la matrice diventa quindi 3x4.

La maggioranza delle interazioni proteina-acidi nucleici avviene sul solco maggiore. Il codice è

abbastanza semplice, una proteina deve andare a riconoscere le sequenze guardando lungo il dna

la sequenza di basi che corrisponde. Il riconoscimento tipicamente avviene tramite riconoscimento

da parte delle catene laterali di amminoacidi della proteina che riconosce il dna. I fattori di

trascrizione hanno quasi tutti in genere un dominio strutturale elica-ansa-elica tale che una delle

due eliche si possa inserire nel solco maggiore; le dimensioni del solco permettono l'inserimento di

un'alfa elica a 45° rispetto all'elica del dna, e con le catene laterali dell'elica vengono riconosciute

le basi azotate. Il famoso operone del lattosio, fattore di trascrizione che è un inibitore della

trascrizione è formato da un tetramero, struttura ad alta simmetria, che presenta un dominio

strutturale elica-ansa-elica che va a riconoscere un solco maggiore del dna. L'operone del lattoso

come tanti fattori di trascrizione è palindromico, è in grado di riconoscere sequenze palindromiche,

in modo da riconoscere un doppio sito di riconoscimento in modo da riconfermarlo (una doppia

interazione è termodinamicamente favorita). Un esempio del fattore di trascrizione, un

meccanismo di attivazione della trascrizione, in questo caso procariota (gli eucarioti sono molto

complessi), il repressore del triptofano, cioè quando il triptofano è disponibile nel mezzo il batterio

smette di fabbricare il triptofano: ci sono una serie di geni ed enzimi che catalizzano la produzione

del triptofano, ma vengono deattivati nel momento in cui il triptofano è presente nel mezzo. Il

triptofano del mezzo si lega al repressore, che cambierà di conformazione in modo che venga

consentito il legame a sequenze specifiche di dna, inibendo il meccanismo di produzione del

triptofano. La sequenza viene riconosciuta attraverso motivi strutturali elica-ansa-elica, l'elica si

piazza nel solco maggiore e con le catene laterali riconosce quegli atomi del codice: nell'elica ad

esempio la glutammina 28 riconosce l'adenina di una coppia AT con due legami idrogeno, sfrutta le

proprietà di accettore di legame idrogeno dell'N7 (ha un doppietto elettronico) e riconosce il

protone dell'NH della glutammina; l'N6 della base è invece un donatore di legame idrogeno che va

a riconoscere l'ossigeno del gruppo ammidico della glutammina. Le basi azotate hanno una zona

impegnata e hanno a disposizione degli atomi che possono essere letti da una sequenza di

amminoacidi senza necessità di svolgere la struttura del dna per raggiungere la sequenza.

Esempio: DNA. Basi azotate: Guanina, Citosina, un'altra guanina, cioè sono due coppie CG. E'

presente un solco. N7 accettore di legame H. O in 6 della Guanina. NH2 citosina. La proteina

incontra questi quattro atomi, il quarto è il CH della citosina in 5.

Esistono anche i riconoscimenti non specifici: la proteina può anche utilizzare dei gruppi carichi

positivamente come le lisine negli istoni, coda di polilisine che riconoscono la catena dei fosfati

senza specificità, possono usare lisine e arginine oppure i gruppi NH del legame peptidico per il

riconoscimento dei gruppi fosfato del dna. Riconoscimento non specifico.

I fattori di trascrizione operano legandosi al dna a doppia elica, riconoscono la sequenza specifica,

riconoscono le posizioni sulla doppia elica del dna e in questo modo gli attivatori si legano a

sequenze specifiche, i fattori di trascrizione generali (fattore sigma della rna polimerasi si lega al

tata-box formando il complesso di inizio della trascrizione).

I fattori di trascrizione hanno tutti dei motivi strutturali che li rendono ben riconoscibili. Leggendo la

sequenza di dna umano si riconosce se la sequenza appartiene ad un fattore di trascrizione o

meno, si riconoscono dei motivi strutturali specifici. Il più comune è il cosiddetto Zinc-finger o dito

di zinco, è presente un atomo di zinco tetracoordinato con 4 amminoacidi, due cisteine e due

istidine (quattro legami di coordinazione, i vertici del legame si trovano all'interno di un tetraedro

regolare). Hanno tutti un foglietto beta antiparallelo con un'alfaelica con cisteine e istidine

equispaziate sulla frequenza: significa che i motivi strutturali a dita di zinco si riconoscono perché

devono avere due cisteine e due istidine, oppure quattro

istidine o quattro cisteine equispaziate sulla sequenza. Chi ne fa

parte? Tutti i recettori degli ormoni steroidei possiedono un

dominio a dita di zinco, il cosiddetto C- terminale, è quello che porta

quel dominio a riconoscere una sequenza di basi sul dna; un

recettore avrà anche una zona che lega il ligando, una sequenza

polipeptidica con un sito attivo in grado di legare un glucocorticoide,

un estrogeno, un progesterone, l'acido retinoico e anche l'ormone

tiroideo. I recettori degli ormoni steroidei sono recettori

nucleari, perché le molecole che riconoscono sono idrofobiche,

passano sulle membrane, possiedono un recettore che è un fattore

di trascrizione direttamente sul nucleo, così la trasmissione dell'informazione è diretta, arriva

l'ormone, si lega al recettore nucleare e si lega poi al dna. Lo zinco non interviene nel

riconoscimento delle basi, lo zinco crea una struttura rigida per porre un'alfa elica di traverso, che

sarà legata allo zinco, e l'alfa elica potrà riconoscere le basi sul solco maggiore.

Un altro motivo strutturale è il leucine-zipper, cerniera di leucine, permette di

introdurre una rappresentazione dell'alfa elica particolare, come una

spirale, piazzando gli amminoacidi in modo che in ogni giro ce ne siano 3,6 (un

giro 3 e un giro 4). Nella rappresentazione si evidenziano amminoacidi che

capitano tutti dalla stessa parte dell'elica; dalla stessa parte dell'elica si

ritroverà sempre lo stesso am