Sintesi combinatoriale

SINTESI COMBINATORIALE

Il principio che regola la sintesi combinatoriale è che soprattutto si differenzia dalla sintesi tradizionale chimica dal fatto che noi all'interno di un reattore andiamo a produrre in maniera simultanea una libreria di composti, questa mi permette di andare appunto a velocizzare i tempi di sintesi, oltretutto andando a formare in breve tempo i composti che hanno caratteristiche simili. La sintesi combinatoriale si è venuta a creare in seguito diciamo così all'avvento dei test farmacologici rapidi ed ad elevata efficienza, i cosiddetti HTS. Ovviamente gli HTS non potevano essere utilizzati per farmaci che venivano sviluppati tramite una sintesi chimica tradizionale in quanto con la sintesi chimica tradizionale andavamo a produrre pochi prodotti in un tempo abbastanza elevato. Lo sviluppo dell'HTS ha portato così alla creazione della sintesi combinatoriale, una metodica che consente di ottenere un'ampia collezione di composti.produrre molecole con varianti è l'utilizzo di scaffold di "tipo ragno" o di "tipo girino". Nel caso degli scaffold di "tipo ragno", si parte da molecole che contengono molti bracci e i sostituenti devono coprire l'intera area superficiale dello scaffold. Questa tecnica è utilizzata per valutare l'unità farmacoforica dei farmaci, quando non si conoscono ancora i gruppi funzionali definiti e le loro disposizioni nel farmaco. Nel caso degli scaffold di "tipo girino", invece, si utilizza un nucleo centrale e i sostituenti sono presenti solo in una porzione dello scaffold, creando una forma simile a quella di un girino. Queste tecniche sono utilizzate per produrre molecole con varianti e possono essere applicate per valutare specifiche parti del target biologico.MIX AND SPLIT. A differenza della procedura tradizionale, questo metodo ci consente di velocizzare e di ottenere un numero di composti maggiore. Si va a procedere in fase solida. Se noi consideriamo l'esempio della sintesi peptidica, abbiamo le sferette di resina e a livello delle quali è legato un linker in maniera covalente che presenta un gruppo funzionale che permette di ancorare la catena, in questo caso polipeptidica, in corso di formazione. Quindi abbiamo un reagente che verrà collegato e un reagente che sarà nella fase liquida. Ci permetterà questa procedura di utilizzare ampi eccessi di reagente e la sintesi potrà essere portata al massimo della efficienza e avremo una resa anche massima, non bisognerà neanche purificare perché semplicemente si può procedere lavando tutto ciò che non si è legato e recuperare il tutto senza il problema di dover staccare.quindi la catena polipeptidica in corso di formazione. Si procede ad esempio se partiamo da 3 amminoacidi A, B, C differenti; legando queste strutture a livello delle sferette di resina. Dopodiché si mixa appunto e si suddivide in contenitori differenti, ad esempio se vogliamo ottenere 27 prodotti, consideriamo 33, quindi il numero di sostanze iniziali per il numero di passaggi e le suddividiamo quindi in 3 diversi reattori. Successivamente introduciamo in ciascuno un monomero differente, per esempio nel primo A, nel secondo B, nel terzo C e si procede con le fasi di elongazione, si stabilisce il legame peptidico tra i diversi monomeri e successivamente si mixa di nuovo e si splitta, quindi il gran numero di prodotti ottenuti dipende proprio da questo, che ad ogni passaggio si ripete l'operazione di separazione e miscelazione. [In pratica A lo leghi ad A, B, C. B lo leghi ad A, B, C. C lo leghi ad A, B, C e così si ottengono 9 composti] SINTESI COMBINATORIALE ESTESA In passato,

Il passaggio più lento nella sintesi di un nuovo farmaco, era rappresentato dai saggi biologici, con l'avanzamento di test sempre più efficienti (come i test HTS, cioè proprio test ad elevata efficienza) è stato possibile saggiare una vasta quantità di molecole. Per questo, negli ultimi anni lo stadio più lento nello sviluppo di un farmaco è proprio lo stadio sintetico. Nasce da quella sintesi combinatoriale, una metodica che consente di ottenere un'ampia collezione di prodotti che hanno varianti nei confronti di una struttura comune. Questi composti ottenuti prendono il nome di LIBRERIE COMBINATORIALI: io avrò una serie di composti attivi, altri non lo saranno ma comunque quelli non attivi contro quel target potrebbero essere attivi su altri quindi non vanno "buttati" ma conservati. La progettazione di un farmaco può essere basata sul Ligando o sulla struttura 3D del bersaglio. Progettazione basata sui

ligandi: Si basa sulla rappresentazione 3D del farmacoforo. Una volta note le caratteristiche del farmacoforo posso ricercare questi requisiti strutturali in un database, per esempio, e quindi risalire a tutte quelle strutture utili da sintetizzare per l'interazione con quel target.

Sono circa 30 gli scaffold che rappresentano circa la metà dei farmaci in commercio. Il primo a definire dei parametri per considerare un farmaco utile fu Lipinski con la regola del 5:

• PM < 500
• Numero di donatori di H < 5
• Numero di accettori H < 10
• LogP < 5

Questo ha portato alla regola di Weber che ha preso in considerazione un altro importante parametro, la FLESSIBILITÀ, cioè il numero di legami rotabili. È un parametro importante per la biodisponibilità orale. Parametri regola di Weber:

• Numeri legami rotabili minore o uguale a 10
• Totale legami idrogeno minore o uguale a 12
• Area superficiale totale minore a 140 Ångström (Å)

Per la sintesi di piccole

molecole si parte da molecole scaffold di tipo RAGNO che contengono tanti bracci. Con una molecola come questa è più facile esplorare l'ambiente conformazionale del target; posso legare i miei sostituenti a delle distanze definite. Lo scaffold di tipo ragno è molto più utile delle molecole di tipo GIRINO in cui i sostituenti sono tutti dalla stessa parte.

Progettazione basata sulla struttura del bersaglio:

Il tutto parte dalla struttura 3D del bersaglio. Ormai esistono numerose banche dati di target biologico. Se ho nota la struttura 3D del target, quindi so dove sono localizzati i vari siti di interazione, posso procedere nella progettazione valutando le possibili interazioni che una serie di ligandi possono instaurare con il target. Quindi uso dei software (i software di "docking"), dove posso mimare la possibilità di interazione di vari ligandi con il target, in corrispondenza dei siti attivi. Per ogni tipo di interazione viene assegnato

Un punteggio, e in funzione di questi valuto quale siano i ligandi migliori e in particolare anche quale sia la loro conformazione (le migliori ovviamente sono quelle più stabili, cioè a minore energia).

PREPARAZIONE DELLE LIBRERIE

Come detto ci sono dei software per progettare librerie combinatoriali mirate per un target. I "descrittori molecolari", cioè quello che bisogna prendere in considerazione è:

• PM
• Idrofobicità
• Gruppi donatori/accettori di legame H
• Presenza/assenza di gruppi funzionali
• Flessibilità (e quindi numero di legami rotabili)

Dopodiché non posso non considerare che lo stesso ligando può interagire con conformazione diversa con il target quindi devo usare necessariamente dei software per il docking che considerino la flessibilità del ligando. Ci sono vari metodi:

1. Il primo prevede la suddivisione del ligando in vari frammenti; seleziono il frammento più rigido,

chiamato “àncora”.Il primo apporccio valuta la capacità d’interazione del ligando, la capacità dell’àncora di inserirsi e quindi reagire conil target. Dopo che ho trovato la configurazione più stabile, aggiungo poco a poco i gruppi funzionali.

2) Un’altra possibilità è di effettuare il docking (che letteralmente significa “inserimento”) considerando l’aspettochimico, per complementarietà chimica! Anche qui conviene la suddivisione in frammenti, partendo da quello piùrigido. E’ necessario che vengono identificati almeno 2 TRIANGOLI FARMACOFORICI COMPLEMENTARI (unodell’àncora e uno del sito di legame e questi devono avere distanza e angoli il più possibile simili).

3) Un’altra possibilità ancora è quella che prevede l’utilizzo di SONDE CHIMICHE rappresentate di fatto da gruppifunzionali. In una prima fase uso le sonde chimiche e

valuto la capacità di questi gruppi funzionali di interagire con il target (attribuendo dei punteggi). La seconda fase è la frammentazione del ligando e valuto il possibile appaiamento dei frammenti con le sonde. Tutte queste applicazioni si sono rese possibili soprattutto con la sintesi in fase solida, che dà la possibilità di automatizzare il processo e ottenere una grande varietà di prodotti in un breve arco di tempo. Il materiale di partenza è legato a delle sferette di resina che saranno insolubili ai reagenti che userò (uno o più reagenti in sequenza). VANTAGGI DELLA SINTESI IN FASE SOLIDA:
1. I materiali di partenza sono immobilizzati su un supporto solido (sferette di resina), risultando quindi fisicamente distinti e possono essere trattati, in sequenza, con più reagenti.
2. È possibile operare con eccessi di reagenti e spingere quindi la reazione al massimo dell'efficienza.
3. È possibile rimuovere, attraverso

dei lavaggi, l'eccesso di reagenti

4) In una sequenza di reazione gli intermedi sono legati alle sferette e non necessitano purificazione

5) I singoli prodotti possono essere facilmente separati dalle sferette

6) Le procedure possono essere automatizzate

METODO MIX AND SPLIT

Per quanto riguarda il metodo mix and split è una procedura che ci permette di ottenere in brevissimo tempo delle grandi collezioni di composti con generi chiamate librerie. A differenza della procedura tradizionale nella quale ad esempio se vogliamo ottenere a partire da 5 peptidi, da 5 singoli monomeri quindi diversi di peptidi, che prevede quindi di effettuare 25 reazioni differenti che comportano ciascuna una protezione, una condensazione e poi una deprotezione, questo metodo ci consente di velocizzare la procedura e di ottenere un numero di composti maggiore. Quindi si procede in fase solida ed inizio ad illustrare l'esempio della sintesi peptidica. Sei noi consideriamo l'esempio della sintesi

peptidica abbiamo le sferette di resina e a livello delle quali è legato un linker in maniera covalente che presenta un gruppo funzionale che permette di ancorare la catena, in questo caso polipeptidica in corso di formazione.