Appunti del corso di Sintesi e analisi strutturale di biomolecole

RISONANZA MAGNETICA NUCLEARE (NMR)

La spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) è una tecnica che permette di ottenere informazioni sulla struttura delle molecole osservando il comportamento dei nuclei atomici in un campo magnetico.

SPIN NUCLEARE

Alcuni nuclei hanno una proprietà chiamata spin (momento angolare) e come conseguenza si comportano come se ruotassero nello spazio in senso orario o antiorario intorno al proprio asse. I nuclei che hanno uno spin, posseggono un numero dispari di protoni (tipo H, C) e solo questi possono essere studiati all'NMR. Al contrario, nuclei tipo C non ha spin e quindi non possono essere studiati all'NMR.

Con le onde radio possiamo provocare delle transizioni tra livelli di spin nucleare. Esempio: come (quindi senza l'elettrone) Prendiamo in considerazione l'H protone e tale protone può ruotare nello spazio descrivendo il suo spin. Quando parliamo di spin stiamo definendo un vettore che si lungo.

l'asse dichiama momento angolare o momento di spin P. Tale vettore P è orientato rotazione. Se il protone ruota in senso antiorario, la direzione del vettore P sarà verso perché segue la regola della mano destra. La grandezza del vettore è data dalla seguente formula: (si legge acca tagliato) Dove: un indice dell'intensità (o I= numero quantico di spin. (da 0 a 6 compreso i numeri frazionari) ed è modulo) di questo momento angolare. L'NMR ci dice che dobbiamo immergere i nostri nuclei all'interno di un campo magnetico statico che abbia una direzione fissa lungo l'asse z cartesiano. Dobbiamo quindi andarci a calcolare la l'asse Z componente del vettore P lungo : assume valori tra –I e +I) (m= numero quantico di spin, → Quindi se I =1/2 m = + ½ e -1/2 → Se I = 1 m = +1, 0, -1

MOMENTO MAGNETICO NUCLEARE Un nucleo, oltre allo spin, possiede anche un momento magnetico e ruotando genera un µ

protoni allineati in direzione opposta al campo magnetico sono nello stato di spin beta a energia più alta (perché è necessaria più energia per allineare i momenti magnetici contro il campo che con il campo).

Allo stato alfa corrisponde m= + 1/2

Allo stato beta corrisponde m= -1/2

Ci sono più nuclei nello stato alfa che nello stato beta. La differenza di popolazione è molto piccola (circa 20 protoni su 1 milione) ma è sufficiente a fornire le basi per la spettroscopia NMR.

IL FENOMENO DELLA RISONANZA

La differenza di energia tra gli stati alfa e beta, dipende dalla forza del campo magnetico applicato (B): maggiore è la forza del campo magnetico, maggiore è la differenza di energia tra gli stati di spin alfa e beta.

Quando il campione è sottoposto ad un impulso di radiazione la cui energia corrisponde alla differenza di energia tra gli stati di spin alfa e beta, i nuclei nello stato alfa sono promossi allo stato beta. Quindi

Quando i nuclei assorbono tale radiazione, invertono lo stato di spin e dopo aver spento la fonte di eccitazione, generano un segnale (emettono radiazione) la cui frequenza dipende dalla differenza di energia tra alfa e beta. Lo spettrometro NMR rileva questi segnali e li rappresenta su di un grafico. Il fenomeno della risonanza infatti si basa sull'analisi del rilassamento dei nuclei dopo essere stati eccitati. Siccome il deltaE tra gli stati energetici alfa e beta è molto piccolo, affinché i nuclei allo stato alfa possano essere eccitati e saltare allo stato beta, è necessario fornire una radiazione elettromagnetica con un contributo energetico molto piccolo, le onde radio.

Ora dobbiamo capire quale sia l'equazione dell'NMR. La fisica ci dice che l'energia di un dipolo magnetico in un campo magnetico è uguale a E = -mu B (mu = vettore momento magnetico di 0, ma a noi interessa la direzione dei vettori lungo l'asse Z).

Il campo magnetico esterno influisce sul comportamento dei nuclei atomici, generando un campo magnetico interno chiamato campo magnetico nucleare. Questo campo magnetico nucleare può essere rappresentato da un vettore chiamato momento magnetico nucleare (m). La direzione e l'intensità di m dipendono dallo spin nucleare, che può essere +1/2 o -1/2.

La differenza di energia tra gli stati di spin +1/2 e -1/2 è data dalla formula:

ΔE = γB₀

Dove γ è la costante di proporzionalità chiamata rapporto giromagnetico e dipende dal nucleo che stiamo analizzando. B₀ è l'intensità del campo magnetico esterno.

La frequenza di Larmor, che è la frequenza di assorbimento nel fenomeno NMR, è direttamente proporzionale al campo magnetico esterno:

ν = γB₀

L'intensità del segnale NMR dipende dalla differenza di popolazione tra gli stati di spin +1/2 e -1/2. Questa differenza di popolazione può essere determinata dalla distribuzione di Boltzmann, che segue la legge di Boltzmann. La popolazione degli stati di spin segue questa legge in base all'energia che separa i due stati.

La formula dell'NMR dipende dalla temperatura, ma ci viene in aiuto perché abbiamo visto che né è direttamente proporzionale all'energia, ma l'energia o la frequenza dipendono dal campo magnetico. Quindi possiamo aumentare il campo magnetico a dismisura per rendere quella differenza di energia grande quanto vogliamo. E quindi abbiamo risolto almeno per il protone il problema della sensibilità.

EFFETTO DELLO SCHERMO

Abbiamo visto che la frequenza di un segnale NMR dipende dalla forza del campo magnetico applicato. Quindi, se tutti gli H di un composto sperimentassero lo stesso campo magnetico, dovrebbero dare segnali alla stessa frequenza. Se fosse questo il caso, tutti gli spettri NMR consisterebbero in un solo segnale e non ci direbbero nulla sulla struttura di un composto. Tuttavia il nucleo è immerso in una nuvola di elettroni che producono un campo magnetico locale che lo scherma parzialmente dal campo magnetico applicato.

(effetto schermante). Il campo magnetico effettivo, perciò è più piccolo del campo magnetico applicato: B = B - Beffettivo applicato locale. Questo significa che maggiore è la densità elettronica dell'intorno in cui si trova il protone, maggiore è B e il protone risulta più schermato dal campo magnetico applicato locale. Tutto ciò che è dentro viene schermato mentre tutto ciò che è fuori invece viene deschermato (un nucleo deschermato è impoverito di elettroni). Come possiamo creare questo impoverimento o questo aumento di densità elettronica? Mettendo vicino il protone un atomo elettronegativo, perché il protone si tira gli elettroni e quindi il nucleo risulterà deschermato. Viceversa se poniamo un metallo elettropositivo che dona elettroni al protone che stiamo analizzando, il nucleo risulterà schermato. Questo è importante perché ci spiega il termine shift.