Secondo semestre genetica

Le mutazioni

Attraverso il processo di mutazione si produce un cambiamento in una coppia di basi del DNA o in un cromosoma. La mutazione è il risultato di questo cambiamento. Quindi la mutazione può essere il risultato di qualsiasi cambiamento che alteri la costituzione chimica o fisica del DNA. Una mutazione può essere trasmessa alle cellule figlie e alle generazioni seguenti dando quindi origine a cellule mutate o a individui mutati (mutazioni germinali/mutazioni somatiche).

Le mutazioni possono avvenire spontaneamente, ma possono anche essere indotte sperimentalmente (mutazioni spontanee/mutazioni indotte). Tra queste due mutazioni non v’è differenza qualitativa.

Tipi di mutazioni

Le mutazioni possono essere di tre tipi:

• Geniche: Sono mutazioni che avvengono a livello della sequenza di un gene e possono essere dovute a una qualsiasi alterazione nella sequenza del DNA del gene. In queste mutazioni può esserci il cambiamento di una (sono dette allora mutazioni puntiformi) o poche basi all’interno di un singolo gene. Possono essere causate da errori nella replicazione, cambiamenti chimici spontanei e cambiamenti causati da agenti fisici o sostanze chimiche.
• Genomiche: Sono mutazioni dove c’è un cambiamento che coinvolge uno o più cromosomi.
• Cromosomiche: È un cambiamento nell’organizzazione di un cromosoma o di più cromosomi, sono anche dette aberrazioni cromosomiche.

Gene e prodotto genico

Il gene mutato sottopone l’individuo a selezione naturale a favore se la mutazione migliora l’adattamento all’ambiente, contraria se la peggiora.

Teorie sulle mutazioni

La variabilità della specie è causata dall’ambiente o dalle mutazioni? Nel Novecento la teoria di Lamarck ipotizzava che fosse l’ambiente a indurre cambiamenti a livello del patrimonio genetico, che è poi, così mutato, ereditato dalla progenie. L’esperimento di Luria e Delbrück nel 1943 dimostrò che le mutazioni avvengono casualmente. Gli effetti fenotipici vengono visualizzati in presenza di fattori ambientali che selezionano tali effetti.

Esso venne condotto con le cellule di Escherichia coli, che, sensibili all’infezione da parte del fago T₁, morivano infettate. Venne preso in esame uno stesso ceppo di Escherichia coli, diviso poi in venti provette e in una grande beuta e lasciato crescere in assenza del fago, nelle stesse condizioni e con lo stesso numero di generazioni.

Il contenuto di ogni provetta venne piastrato su terreno solido (coltura singola) e dalla coltura nella beuta vennero prelevati vari campioni e piastrati anch’essi su terreno solido (coltura massiva). A tutti i campioni venne aggiunta la stessa quantità di fagi T₁.

Risultati dell'esperimento

A questo punto si sarebbero potuti avere due risultati:

• Mutazione indotta dal contatto col fago: La frazione di cellule mutate (resistenti) è sempre la stessa.
• Mutazione casuale: Le cellule mutano indipendentemente dalla presenza del fago e si osservano frazioni variabili di cellule mutate nei vari esperimenti. In questo caso la mutazione viene trasmessa alla progenie.

Il risultato fu quello di mutazione casuale. La coltura massiva non mostrava una grande variabilità nei singoli piastramenti (il rapporto tra varianza e media è circa uno), mentre le singole colture presentavano fluttuazioni molto ampie (il rapporto è circa 6,1). Se la resistenza al fago T₁ fosse causata da un adattamento fisiologico, in entrambi i gruppi di piastre sarebbero attese fluttuazioni piccole e della stessa ampiezza.

La spiegazione più plausibile di questo risultato era che nelle colture si fossero verificate mutazioni casuali in momenti diversi. Le mutazioni avvenute più precocemente davano origine ad un numero maggiore di colonie resistenti, mentre quelle avvenute più tardivamente davano origine a un numero minore di colonie resistenti. Se le mutazioni non erano avvenute affatto, nessuna colonia resistente cresceva sulle piastre.

Mutazioni silenti e geniche

Poiché la maggior parte di DNA è Junk-DNA (non codificante), le mutazioni che avvengono a livello delle regioni non codificanti non si manifestano a livello genotipico, sono le cosiddette mutazioni silenti, che vengono trasmesse, ma non vi è alcuna selezione contro.

Ci sono poi le mutazioni geniche, le quali alterano la funzionalità del prodotto proteico. Anch’esse vengono trasmesse, ma, a differenza delle mutazioni silenti, su di loro agisce una selezione.

Differenziazione tra mutazioni

Un’altra differenziazione è tra le mutazioni somatiche e le mutazioni germinali.

• Mutazioni somatiche: Avvengono in una cellula somatica, il fenotipo mutante si presenterà solo nella discendenza di quella cellula. Questa mutazione non coinvolgerà la linea germinale, quindi non verrà trasmessa alla progenie.
• Mutazioni germinali: Avvengono nelle cellule della linea germinale; le cellule somatiche hanno sequenza normale, quindi il portatore non manifesta la malattia a livello fenotipico, perché le cellule somatiche hanno sequenza normale. La mutazione viene trasmessa allo zigote, che avrà però la mutazione visibile anche a livello somatico oltre che a livello germinale, quindi manifesterà il fenotipo e lo trasmetterà alla progenie. La mutazione che non viene manifestata dal genitore fenotipicamente è una mutazione insorta sporadicamente nei suoi gameti. Per questo il genitore non la manifesta: i figli invece la manifesteranno perché coinvolgerà la loro linea somatica.

NB: Se le mutazioni sono di tipo dominante i loro effetti si esprimono immediatamente nella progenie; se sono invece recessive i loro effetti nei diploidi sono spesso nascoste.

Mutazioni che alterano una sola base

(Mutazioni puntiformi)

Possono essere di due tipi:

• Spontanee: Nascono da errori nella sintesi del DNA o da cambiamenti chimici spontanei.
• Indotte: Nascono da un mutagene chimico o fisico.

Mutazioni spontanee

Mutazioni per sostituzione

Sono cambiamenti in un gene tali per cui una coppia di basi viene rimpiazzata da un’altra coppia di basi, per esempio AT, che può essere sostituita da GC. Per il 63% sono dovute a transizione, ovvero la sostituzione di una purina (A e G) con un’altra purina, o di una pirimidina (C e T) con un’altra pirimidina. Per il 37% sono dovute a transversione, ovvero la sostituzione di una purina (A e G) con una pirimidina (C e T) o viceversa.

Effetto delle mutazioni per sostituzione

Le mutazioni possono essere anche definite in base agli effetti sulla sequenza aminoacidica; i tipi di mutazione seguenti possono essere causati da sostituzioni di coppie di base:

• Missenso (mutazione missenso): È una sostituzione genica nella quale la sostituzione di una coppia di basi nel DNA causa un cambiamento nel codone dell’mRNA, con il risultato che nel polipeptide viene inserito un aminoacido differente al posto di quello specifico del codone selvatico e il fenotipo risulta mutato; per esempio una transizione da AT a GC cambia il codone per la lisina (AAA) in un codone per l’acido glutammico (GAA).
• Non senso: È una sostituzione di una coppia di basi nel DNA che determina nell’mRNA un cambiamento da un codone che specifica per un amminoacido a un codone di stop (UAG, UAA, UGA). Questa mutazione determina la fine prematura della proteina e prevede quindi il rilascio dai ribosomi di frammenti polipeptidici, normalmente non funzionanti.
• Neutra: È una sostituzione di una coppia di basi in un gene che cambia un codone nell’mRNA, ma l’aminoacido risultante non determina alcuna alterazione nella funzionalità della proteina prodotta. Una mutazione neutra è un tipo di mutazione missenso, nella quale il codone mutato codifica per un aminoacido diverso, ma chimicamente equivalente, in quanto i due hanno caratteristiche simili, per esempio la lisina (AAA) è sostituita con l’arginina (AGA).
• Silente: È una specie di mutazione missenso e si verifica quando viene cambiato un codone nell’mRNA in modo tale da codificare ancora per lo stesso aminoacido. Di solito a cambiare è la IIIª base del codone (vacillamento della terza base). Nonostante la mutazione, esso continua a codificare per lo stesso amminoacido.

Frame shift – scivolamento della reading frame

È il risultato di un’inserzione o di una delezione di una o piùcoppie di base in un gene. E’ possibile avere un’inserzione o una delezione. Con un’inserzione si ha l’aggiunta di una base e con una delezione si ha la rimozione di una base, ma in entrambi i casi è possibile, a volte, lasciare immutato l’effetto fenotipico.

Sempre in entrambi i casi avrò una lettura alterata nel momento in cui la delezione o l’inserzione saranno a valle del codone, in quanto verranno incorporati nella proteina aminoacidi sbagliati. Può anche accadere che uno dei codoni che si originano in seguito allo sfasamento della lettura sia un codone nonsenso; in questo caso verrà prodotto un polipeptide più corto del normale.

La reversione e le mutazioni soppressore

Le mutazioni puntiformi possono essere distinte in due classi in base al loro effetto sul fenotipo.

• Le mutazioni in avanti, che sono mutazioni che causano un cambiamento genotipico in direzione dal selvatico al mutante.
• Le mutazioni per reversione, invece, causano un cambiamento genotipico dal mutante al selvatico. La reversione di una mutazione nonsenso, per esempio, avviene quando cambia una coppia di basi del DNA in corrispondenza del codone nonsenso dell’mRNA, così che il nuovo codone può nuovamente codificare per un aminoacido.

La reversione può essere vera o parziale. Se la reversione porta a codificare un aminoacido diverso, la reversione è una reversione parziale, che può tuttavia restaurare la funzionalità della proteina. Se la reversione porta all’aminoacido originario, la reversione è una reversione vera.

Esempio:

• UCG (serina) UAG (stop) UCG (serina, vera reversione)
• UCG (serina) UAG (stop) UGG (triptofano, reversione parziale)

Gli effetti di una mutazione possono essere diminuiti o aboliti da una mutazione soppressore, che è una mutazione in un secondo sito, nello specifico può avvenire in un sito lontano da quello in cui è inserita la prima mutazione, mascherandone gli effetti o compensandoli.

Vi sono due principali classi di soppressori:

• Soppressori intragenici: Portano a una mutazione che avviene nello stesso gene in cui è avvenuta la prima mutazione.
• Soppressori intergenici: Sono mutazioni che avvengono in un gene diverso da quello in cui è avvenuta la prima mutazione. Generalmente, i soppressori di mutazione nonsenso sono particolarmente ben caratterizzati in E. coli e lievito, dove specifici geni per tRNA possono mutare in modo che i loto anticodoni riconoscono un codone di terminazione nell’mRNA e inseriscono un aminoacido nella catena (al contrario dei tRNA selvatici). Di conseguenza, invece di terminare precocemente la sintesi della catena polipeptidica in corrispondenza del codone nonsenso, il tRNA alterato (soppressore) inserisce un aminoacido in quella posizione e questo aminoacido può riportare alla funzionalità totale o parziale del polipeptide. Dato che ci sono tre tipi di codoni nonsenso (UAA, UGA, UAG), ci saranno tre classi di soppressori.

Cause delle mutazioni

Le mutazioni possono avvenire spontaneamente o possono essere indotte.

Le mutazioni spontanee

Le mutazioni spontanee sono mutazioni che possono avvenire in fase S, in fase G₁ e in fase G₂ del ciclo cellulare. Il tasso di mutazione, ovvero la probabilità che si verifichi un particolare tipo di mutazione in funzione del tempo, è 10^-4 - 10^-6 per quanto riguarda gli eucarioti in generale per gene per generazione mentre è 10^-6 – 10^-7 per quanto riguarda i batteriofagi per gene per generazione. Sono quelle mutazioni che sfuggono al sistema di correzione. La maggior parte delle mutazioni finora identificate sono mutazioni deleterie e recessive. I processi metabolici avvengono attraverso una serie di reazioni chimiche, in cui ogni singolo passaggio è catalizzato da uno specifico enzima codificato da uno o più geni. Le mutazioni di questi geni producono, di frequente, blocchi delle vie metaboliche. Molte mutazioni non hanno effetto sul fenotipo dell’organismo a causa della degenerazione che si osserva nel codice genetico. Queste sono chiamate mutazioni neutre. E nel caso si tratti di un omozigote recessivo?

Il caso dell’anemia falciforme

È una malattia genetica a trasmissione autosomico – recessiva. E’ una mutazione che si manifesta allo stato di omozigote e porta al cambiamento di un amminoacido nell’emoglobina, una proteina che trasporta O₂.

L’emoglobina

Negli adulti (emoglobina A) la principale forma di emoglobina è costituita da due polipeptidi α, tra loro identici, e due polipeptidi β, sempre identici. Ogni polipeptide è formato da una specifica sequenza di 141 aminoacidi, mentre ogni catena β è formata da 146. Date le similarità presenti nelle loro sequenze aminoacidiche, si pensa che tutte le catene globiniche derivino da un comune progenitore. Tra le varianti identificate nell’emoglobina adulta è presente l’anemia falciforme. Nell’anemia falciforme (emoglobina S), si scoprì che la S differiva dalla A in una sola posizione. Il sesto aminoacido dell’estremità ammino-terminale della catena β nell’emoglobina A è un acido glutammico (carico negativamente); la catena β dell’emoglobina S, invece, contiene nella stessa posizione una valina (neutro). La mutazione prevede che la sequenza codificante per l’acido glutammico (GAA) muti, andando a codificare per valina (GUA). A causa del diverso ripiegamento della proteina, la quale passa quindi dall’essere carica negativamente all’essere apolare, il fenotipo del globulo rosso cambia, andando a costituire la caratteristica forma a falce. Questo genere di globuli rossi sono molto più fragili e tendono a bloccarsi nei capillari portando un danno alla circolazione e ai tessuti (è pleiotropia).

a: allele normale, emoglobina normale Hb-A; s: allele mutato, emoglobina mutata Hb-S

• a/a: individui sani
• s/s: individui affetti
• a/s: individui portatori (fenotipo intermedio)

Un’altra mutazione che porta all’anemia, in particolare all’emoglobina di tipo C, Hb-C, è la sostituzione dell’acido glutammico con la lisina; tuttavia è meno grave perché il ripiegamento della proteina è simile a quello di un individuo sano.

Cause delle mutazioni spontanee

Errori durante la replicazione: Sia mutazioni puntiformi, sia corte inserzioni sia delezioni possono avvenire per errore durante la replicazione del DNA. Appaiamento vacillante delle basi e tautomeria chetoenolica che porta alla sostituzione di base. Nelle basi si ha il gruppo chetonico (c=o) o il gruppo enolico (OH), che sono due conformazioni in equilibrio. Se l’equilibrio si sposta durante la replicazione del DNA a favore di uno dei due tautomeri, anche se questo richiede maggior energia, potremmo avere un appaiamento di basi non canonico e quindi una mutazione.

Nella sua forma rara, infatti, una base può formare legami idrogeno diversi rispetto a quelli normali e ciò può portare a un appaiamento errato. Per quanto riguarda le pirimidine, una forma rara di citosina può appaiarsi con l’adenina e una forma rara di timina può appaiarsi con la guanina. Scivolamento e misappaiamento che, in sequenze ripetute, portano a inserzione e delezione. La delezione di una base del filamento di nuova sintesi si ha quando nel filamento stampo una base protrude e non viene copiata nel nuovo filamento. Quando si ha una protrusione nel filamento di nuova sintesi si ha l’inserzione di una base in quest’ultimo. Se avvengono nella regione codificante di un gene strutturale, queste inserzioni o delezioni nel DNA daranno luogo a mutazioni frameshift. (Ho eccezione se le basi sono tre)

Cambiamenti chimici spontanei del DNA

Due dei più comuni eventi chimici che portano alla produzione di mutazioni spontanee sono la depurinazione e la deaminazione. Se l’appaiamento non canonico avviene nel filamento senso, questo non verrà trascritto, quindi la mutazione non sarà visibile nella prima generazione.

La depurinazione: Una purina viene persa a causa della rottura del legame con il desossiribosio. Normalmente vi è un meccanismo che ripara la perdita, ma se la base non viene ripristinata non ci sarà una base che serva da stampo per quella complementare e si creerà quindi un buco. Se la lesione sfugge alla riparazione si inserirà una base a caso, che potrà produrre una coppia di basi con appaiamento errato. Il risultato sarà una mutazione genica.

La deaminazione: è la rimozione di un gruppo amminico da una base, per esempio deaminazione di citosina produce un uracile, che, essendo riconosciuta come base estranea, è rimossa dal DNA. Quando una U non viene riconosciuta come base estranea, invece, si accoppia ad una adenina (transizione da C-G a U-A).

Il DNA dei procarioti e degli eucarioti contiene, al posto della normale base citosina, una piccola quantità di basi modificate a 5-metilcitosina. Le citosine metilate, che vanno incontro a deaminazione diventano timine, le quali si accoppiano poi con le adenine (transizione da C-G a T-A).

Le citosine 5’ (metilate al carbonio 5’) localizzate al 5’ (promotore) vanno incontro a un maggior numero di deaminazioni, quindi vanno incontro a più sostituzioni per transizione.

Esistono delle regioni ricche di 5’ e sono dette hot spots (punti caldi mutazionali), luoghi che subiscono un numero di sostituzioni per transizione superiori alla media.

Mutazioni indotte

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