Secondo semestre genetica

restaurare la funzionalità della proteina.

Se la reversione porta all’aminoacido originario; la reversione è una reversione vera.

Esempio:

UCG (serina) UAG (stop) UCG (serina, vera reversione)

UCG (serina) UAG (stop) UGG (triptofano, reversione parziale)

Gli effetti di una mutazione possono essere diminuiti o aboliti da una mutazione soppressore, che è una mutazione in

un secondo sito, nello specifico può avvenire in un sito lontano da quello in cui è inserita la prima mutazione,

mascherandone gli effetti o compensandoli.

Vi sono due principali classi di soppressori:

soppressori intragenici: portano a una mutazione che avviene nello stesso gene in cui è avvenuta la prima

mutazione.

UUA(leucina) UUU (fenilalanina) CUU(leucina)

soppressori intergenici: sono mutazioni che avvengono in un gene diverso da quello in cui è avvenuta la prima

mutazione.

Generalmente, i soppressori di mutazione nonsenso, sono particolarmente ben caratterizzati in E. coli e lievito, dove

specifici geni per tRNA possono mutare in modo che i loto anticodoni riconoscono un codone di terminazione

nell’mRNA e inseriscono un aminoacido nella catena (al contrario dei tRNA selvatici).

Di conseguenza, invece di termianre precocemente la sintesi della catena polipeptidica in corrispondenza del codone

nonsenso, il tRNA alterato (soppressore) inserisce un aminoacido in quella posizione e questo aminoacido può

riportare alla funzionalità totale o parziale del polipeptide.

Dato che ci sono tre tipi di codoni nonsenso (UAA, UGA, UAG), ci saranno tre classi di soppressori.

CAUSE DELLE MUTAZIONI

Le mutazioni possono avvenire spontaneamente o possono essere indotte.

LE MUTAZIONI SPONTANEE: sono mutazioni che possono avvenire in fase S, in fase G e in fase G del ciclo cellulare.

1 2

Il tasso di mutazione, ovvero la probabilità che si verifichi un particolare tipo di mutazione in funzione del tempo, è,

-4 -6 -6 -7

10 - 10 per quanto riguarda gli eucarioti in generale per gene per generazione mente è 10 – 10 per quanto

riguarda i batteriofagi per gene per generazione.

Sono quelle mutazioni che sfuggono al sistema di correzione.

La maggior parte delle mutazioni finora identificate sono mutazioni deleterie e recessive. I processi metabolici

avvengono attraverso una serie di reazioni chimiche, in cui ogni singolo passaggio è catalizzato da uno specifico

enzima codificato da uno o più geni.

Le mutazioni di questi geni producono, di frequente, blocchi delle vie metaboliche.

Molte mutazioni non hanno effetto sul fenotipo dell’organismo a causa della degenerazione che si osserva nel codice

genetico. Queste sono chiamate mutazioni neutre.

E nel caso si tratti di un omozigote recessivo?

IL CASO DELL’ANEMIA FALCIFORME: è una malattia genetica a trasmissione autosomico – recessiva.

E’ una mutazione che si manifesta allo stato di omozigote e porta al cambiamento di un amminoacido

nell’emoglobina, una proteina che trasporta O .

2

L’EMOGLOBINA: negli adulti (emoglobina A) la principale forma di emoglobina è costituita da due polipeptidi ,

tra loro identici, e due polipeptidi , sempre identici.

Ogni polipeptide è formato da una specifica sequenza di 141 aminoacidi, mentre ogni catena è formata da

146. Date le similarità presenti nelle loro sequenza aminoacidiche, si pensa che tutte le catene globiniche derivino

da un comune progenitore. 4

Tra le varianti identificate nell’emoglobina adulta è presente l’anemia falciforme.

Nell’anemia falciforme (emoglobina S), si scoprì che la S differiva dalla A in una sola posizione.

Il sesto aminoacido dell’estremità ammino-terminale della catena nell’emoglobina A è un acido glutammico

(carico negativamente); la catena dell’emoglobina S, invece, contiene nella stessa posizione una valina (neutro)

La mutazione prevede che la sequenza codificante per l’acido glutammico (GAA) muti, andando a codificare per

valina (GUA).

A causa del diverso ripiegamento della proteina, la quale passa quindi dall’essere carica negativamente all’essere

apolare il fenotipo del globulo rosso cambia, andando a costituire la caratteristica forma a falce.

Questo genere di globuli rossi sono molto più fragili e tendono a bloccarsi nei capillari portando un danno alla

circolazione e ai tessuti (è pleiotropia).

a s

: allele normale, emoglobina normale Hb-A : allele mutato, emoglobina mutata Hb-S

a a individui sani

s s individui affetti

a s individui potatori (fenotipo intermedio)

Un’altra mutazione ce porta all’anemia, in particolare all’emoglobina di tipo C, Hb-C, è la sostituzione dell’acido

glutammico con la lisina; tuttavia è meno grave perché il ripiegamento della proteina è simile a quello di un

individuo sano.

Cause delle mutazioni spontanee:

Errori durante la replicazione: sia mutazioni puntiformi, sia corte inserzioni sia delezioni possono avvenire

per errore durante la replicazione del DNA.

Appaiamento vacillante delle basi e tautomeria chetoenolica che porta alla sostituzione di base. Nelle basi si

ha il gruppo chetonico (c=o) o il gruppo enolico (OH), che sono due conformazioni in equilibrio. Se l’equilibrio

si sposta durante la replicazione del DNA a favore di uno dei due tautomeri, anche se questo richiede maggior

energia, potremmo avere un appaiamento di basi non canonico e quindi una mutazione.

Nella sua forma rara, infatti, una base può formare legami idrogeno diversi rispetto a quelli normali e ciò può

portare a un appaiamento errato.

Per quanto riguarda le pirimidine, una forma rara di citosina può appaiarsi con l’adenina e una forma rara di

timina può appaiarsi con la guanina.

Scivolamento e misappaiamento che, in sequenze ripetute, portano a inserzione e delezione.

La delezione di una base del filamento di nuova sintesi si ha quando nel filamento stampo una base protrude

e non viene copiata nel nuovo filamento. Quando si ha una protrusione nel filamento di nuova sintesi si ha

l’inserzione di una base in quest’ultimo.

Se avvengono nella regione codificante di un gene strutturale, queste inserzioni o delezioni nel DNA daranno

luogo a mutazioni frameshift. (Ho eccezione se le basi sono tre)

Cambiamenti chimici spontanei del DNA:

Due dei più comuni eventi chimici che portano alla produzione di mutazioni spontanee sono la depurinazione

e la deaminazione.

Se l’appaiamento non canonico avviene nel filamento senso, questo non verrà trascritto, quindi la mutazione

non sarà visibile nelle prima generazione.

la depurinazione, dove una purina viene persa a causa della rottura del legame con il desossiribosio.

Normalmente vi è un meccanismo che ripara la perdita, ma se la base non viene ripristinata non ci sarà una

base che serva da stampo per quella complementare e si creerà quindi un buco.

Se la lesione sfugge alla riparazione si inserirà una base a caso, che potrà produrre una coppia di basi con

appaiamento errato. Il risultato sarà una mutazione genica.

la deaminazione, è la rimozione di un gruppo amminico da una base, per esempio deaminazione di

Citosina produce un Uracile, che, essendo riconosciuta come base estranea, è rimossa dal DNA.

Quando una U non viene riconosciuta come base estranea, invece, si accoppia ad una adenina (transizione da

C-G a U-A)

Il DNA dei procaroti e degli eucarioti contiene, al posto della normale base citosina, una piccola quantità di

basi modificate a 5-metilcitosina. 5

Le citosine metilate, che vanno incontro a deaminazione diventano timine, le quali si accoppiano poi con le

adenine (transizione da C-G a T-A).

m

Le citosine 5’ (metilate al carbonio 5’) localizzate al 5’ (promotore) vanno incontro a un maggior numero di

deaminazioni, quindi vanno incontro a più sostituzioni per transizione.

m

Esistono delle regioni ricche di 5’ e sono dette hot spots (punti caldi mutazionali), luoghi che subiscono un

numero di sostituzioni per transizione superiori alla media.

MUTAZIONI INDOTTE

Sono quelle causate dall’esposizione degli organismi ad agenti fisici o chimici, che causano cambiamenti nel DNA.

Tali agenti, chiamati mutageni, sono catalogabili principalmente in due categorie:

Mutageni fisici, comprendono:

- Raggi UV: radiazioni non ionizzanti, che portano minore energia rispetto ai raggi X.

Sono in grado di penetrare solo nelle cellule dello strato superficiale e non causano ionizzazioni. I raggi UV

dissipano la loro energia distribuendola agi atomi che incontrano, portando gli elettroni negli orbitali più

esterni a livelli di energia più elevati, uno stato descritto come eccitazione.

Ad alte dosi possono uccidere la cellula, per questo vengono utilizzati per sterilizzare, in quanto, nel

momento in cui colpiscono organismi unicellulari (i microrganismi), questi muoiono.

Come? Poiché le basi del DNA assorbono le lunghezze d’onda dello spettro UV (250-260nm), si ha la

formazione di legami tra pirimidine appartenenti allo stesso filamento, con conseguente protrusione del

filamento di DNA. Per esempio, si può formare T-T al posto di T-A e, se sul dimero T-T viene effettuata una

sostituzione avrò una riparazione, altrimenti la cellula morirà.

- Raggi X: radiazioni ionizzanti ad alta energia, le quali sono in grado di penetrare i tessuti viventi in

profondità. I raggi ad alta energia collidono con gli atomi e determinano il rilascio di elettroni, producendo

radicali liberi e ioni carichi positivamente. Gli ioni, a loro volta, collidono con altre molecole, determinando il

rilascio di altri elettroni. Il risultato è che si forma un cono di ioni lungo il percorso di ogni raggio ad alta

energia attraverso i tessuti viventi.

1 2

A volte provocano la rottura del DNA, mutazioni cromosomiche, con riarrangiamenti strutturali e

3

mutazioni geniche (puntiformi) se le radiazioni hanno bassa energia.

Vi è una relazione tra la dose di raggi X e la frequenza di esposizione, in quanto si ha un accumulo di raggi X

con lunghe e frequenti esposizioni. Ciò prende il nome di effetto cumulativo delle radiazioni.

MUTAGENI CHIMICI: comprendono tre categorie:

- Analoghi delle basi; hanno una struttura molecolare esternamente simile a quella delle basi del DNA e

portano a sostituzioni.

Un analogo delle basi causa mutazioni perché esiste in stati alternativi (tautomeri), uno normale e uno raro.

Le basi e gli analoghi delle basi hanno un diverso equilibrio tra i due tautomeri (gruppo enolico-chetonico). Lo

spostamento dell’equilibrio a favore di uno dei due tautomeri può portare a un accoppiamento non canonico

delle basi.

ESEMPI: 5-bromuroacile (5BU) e 2-aminopurina.

Il 5-bromuracile ha un residuo di bromo al posto del gruppo metilico della timina. Nello stato normale il 5BU

assomiglia alla timina e si appaia con la adenina nel DNA. Nel suo stato raro alternativo si appaia solo con la

guanina.

ll 5BU induce mutazioni perché può cambiare forma una volta che viene incorporato nel DNA.

Dato che l’analogo di base si trova allo stato raro con frequenza molto maggiore rispetto a quanto non

facevano le basi normali, la frequenza di mutazioni indotte dagli analoghi di base è molto più elevata rispetto

alla frequenza di mutazioni spontanee.

Se, per esempio, un 5BU è incorporato nel suo stato normale, esso si appaia con l’adenina.

Se esso passa allo stato raro durante la replicazione, verrà inserita la guanina al posto della adenina come sua

base complementare.

Nel successivo ciclo di replicazione la oppia di basi G-5BU darà luogo a una coppia di basi G-C al posto della

coppia di basi A-T.

Con questo processo viene prodotta una mutazione per transizione da AT a GC.

6

Il 5BU può indurre una mutazione da GC ad AT se viene prima incorporato nel DNA allo stato raro e poi passa

al suo stato normale durante la replicazione.

Quindi le mutazioni indotte da 5BU possono essere revertite da un secondo trattamento con 5BU.

- Modificatori di basi; al contrario degli analoghi delle basi, certe sostanze chimiche modificano la struttura

chimica e quindi le proprietà delle basi invece di sostituirle come facevano gli analoghi.

Ho sostituzioni per transizione.

- Agenti intercalanti; si inseriscono tra le basi del DNA, dando vita a inserzione e delezione.

Avrò rispettivamente un’inserzione nel momento in cui l’agente si intercalerà nel filamento stampo, perché la

DNA polimerasi introduce una base a caso nel filamento di nuova sintesi e avrò, invece, una delezione nel

momento in cui l’agente si intercalerà nel filamento di nuova sintesi.

ESEMPIO: Proflavina

La proflavina mima, infatti, la struttura chimica di due basi azotate appaiate, come quelle presenti nel DNA.

Grazie all'azione di forze di interazione idrofobiche(le cosiddette forze di impilazione o di stacking), la

proflavina può facilmente inserirsi (intercalarsi) tra una coppia di base e quella successiva: se

questa molecola resta intercalata nel DNA sino al successivo ciclo di replicazione può indurre mutazioni

Il caso dell’azidotimidina (AZT)

E’ un analogo della timidina non mutageno, che viene utilizzato per la cura dell’AIDS.

Il virus dell’HIV è un retrovirus (I retrovirus sono un gruppo di virus che utilizza la trascrittasi inversa per

convertire il proprio genoma da RNA a DNA), il quale, una volta entrato nella cellula copia l’RNA in DNA con la

trascrittasi inversa.

L’AZT è un buon substrato per la trascritta inversa, ma non è un buon substrato per la DNA polimerasi

eucariotica, quindi è un farmaco selettivo per bloccare la produzione di DNA virale.

Il DNA prodotto dalla trascrittasi inversa è un DNA complementare, Cdna, che, a differenza del DNA

genomico, non ha introni, in quanto è stato copiato da un trascritto di RNA maturo.

RNA (virus) DNA virale non prodotto!

Il blocco della produzione è avvenuto grazie all’aggiunta di AZT come substrato della trascrittasi inversa.

MECCANISMI DI RIPARAZIONE DEL DNA

La molteplicità dei meccanismi di riparazione che si sono evoluti negli organismi viventi documenta l’importanza del

mantenere le mutazioni a livelli tollerabili; per esempio solo l’Escherichia Coli possiede cinque distinti meccanismi.

I meccanismi sono catalogabili in due principali categorie.

1

Ci sono i meccanismi di riparazione diretta, che prevedono la correzione delle bozze, per la quale nei procarioti

interviene l’esonucleasi in direzione 3’-5’ (non c’è negli eucarioti), la fotoriattivazione con la fotoliasi e l’alchilazione

2

con rimozione del gruppo CH con la metiltransferasi e i meccanismi per escissione, di cui fanno parte il sistema SOS,

3

le metilazioni e l’endonucleasi UvrABC. 7

Alcuni meccanismi di riparazione in dettaglio:

Fotoriattivazione: è un tipo di riparazione che dipende dalla luce. Questa riparazione è effettuata da un enzima

attivato dalla luce, chiamato DNA fotoliasi. Quando il DNA viene esposto alla luce ultravioletta, si producono dimeri di

timina per la formazione di legami covalenti crociati tra residui adiacenti di timina. La DNA fotoliasi si lega ai dimeri di

timina e utlizza l’energia della luce per tagliare questi legami covalenti.

Riparazione per escissione del DNA danneggiato coinvolge generalmente tre stadi:

STADIO I un’endonucleasi di riparazione del DNA o un complesso enzimatico contenente un’endonucleasi

riconosce, si lega ed escinde la base o le basi danneggiata/e del DNA.

STADIO II una DNA Polimerasi riempie i vuoti, utilizzando il filamento non danneggiato complementare di DNA

come stampo.

STADIO III l’enzima DNA Ligasi, per completare il processo di riparazione, salda la rottura lasciata dalla DNA

polimerasi. 1

Vi sono due tipi principali di riparazione per escissione: i sistemi di riparazione per escissione delle basi, che

2

rimuovono dal DNA le basi anormali o chimicamente modificate, e i sistemi di riparazione per escissione di nucleotidi,

che rimuovono difetti più ampi, come i dimeri di timina. Entrambi i sistemi funzionano al buio (a differenza della

fotoriattivazione) e si verificano con meccanismi molto simili in E. coli e nell’uomo.

Escissonucleasi: la UvrABC: è un tipo di riparazione

che prevede l’attività escissionucleasica nell’Escherichia

Coli e richiede i prodotti di tre geni, uvrA, uvrB, uvrC.

Il sistema di riparazione escissionucleasico rimuove dal

DNA lesioni più ampie, come i dimeri di timina e basi con

gruppi laterali voluminosi.

In questo meccanismo, un’unica attività nucleasica di

escissione produce tagli su entrambi i lai dei nucleotidi

danneggiati ed escinde l’oligonucleotide che contiene le

basi alterate.

Una proteina trimerica contenente due polipeptidi UvrA

e uno UvrC riconosce il difetto del DNA, si lega a esso e

utilizza l’energia dell’ATP per ripiegare il DNA a livello del

sito danneggiato.

Il dimero di UvrA è poi rilasciato e la proteina UvrC si lega

al complesso UvrB-DNA ed effettua un taglio al 3’ e un

taglio al 5’. L’elicasi (uvrD) rilascia poi l’oligomero escisso

e la DNA Pol I rimpiazza la proteina UvrB e riempie il

vuoto, utilizzando il filamento complementare come stampo.

La DNA Ligasi salda il tutto.

Mismatch repair è un tipo di riparazione nella quale gli

errori di appaiamento vengono corretti anche quando la

doppia elica è completamente chiusa (perché in questo

caso l’attività di proof-reading, ovvero la correzione di

bozze, della DNA-Pol non ha riconosciuto il mismatch,

ovvero l’errore, durante la sintesi).

In questo caso vi sono dei fattori che riconoscono il

filamento stampo, nel quale tutte le basi sono appaiate

correttamente, grazie alla metilazione dell’adenina di una

sequenza consenso del filamento stampo.

La riparazione chiede i prodotti da tre geni (più l’elicasi):

mutH, mutL, mutS, mutU (MutU=DNA elicasi II)

La proteina MutS riconosce l’appaiamento errato e si lega 8

a esso per dare inizio al processo di riparazione.

Le proteine MutH e MutL si legano poi al complesso. MutH contiene un’attività endonucleasica GATC-specifica, che

taglia il filamento non metilato (di nuova sintesi) nei siti emimetilati (metilati a metà) o al 5’ o al 3’ dell’errore.

I siti in cui avviene il taglio possono essere distanti anche più di 1000 coppie nucleotidiche dall’errore.

Il successivo processo di escissione richiede MutS, MutL, la DNA elicasi II (MutU) e un’appropriata esonucleasi: se il

taglio si ha a livello di una sequenza GATC al 5’ dell’errore è richiesta un’esonucleasi 5’-3’, altrimenti, se il taglio si

trova al 3’ dell’errore è necessaria un’attività esonucleasica 3’-5’.

Negli eucarioti avrò quattro geni hMSH2, hMLH1, hPMs1, hPML2.

Risposta SOS: è un tipo di riparazione che avviene nel momento in cui il DNA è pesantemente danneggiato.

Durante questa risposta SOS viene sintetizzata un’intera batteria di proteine di riparazione, di ricombinazione e di

replicazione del DNA. Due di queste proteine sono le subunità della DNA polimerasi V, un enzima che catalizza la

replicazione del DNA in regioni danneggiate del cromosoma, regioni in cui la replicazione mediante DNA Pol III è

bloccata.

La DNA Pol V permette la progressione della replicazione del DNA attraverso segmenti danneggiati dei filamenti

stampo, anche se le sequenze nucleotidiche di queste regioni non possono essere replicate in modo accurato.

Questo sistema di riparazione soggetta a errore elimina i vuoti nei filamenti sintetizzati ex novo opposti ai nucleotidi

danneggiati nel filamento stampo ma, facendo ciò, aumenta la frequenza di errori durante la replicazione.

Questo sistema di riparazione utilizza quindi le sostituzioni, le quali, solitamente, avvengono nei tratti non codificanti.

Se avvengono sostituzioni in sequenze codificanti, si osserveranno variazioni nel fenotipo.

Il sistema SOS è costruito da 17 geni, la cui espressione, nei procarioti, è regolata da due proteine regolative: LexA e

RecA, che sono in grado di controllare la risposta SOS.

Se non c’è danno: la proteina LexA, legata al DNA, reprime la trascrizione dei 17 geni.

Se c’è un danno: la proteina RecA si attiva e promuove il distacco di LexA dal DNA. Ad avvenuta riparazione il fattore

RecA si inattiva, LexA si riattiva e i geni della riparazione non vengono espressi.

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REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI

I geni ‘costitutivi’ o ‘housekeeping’ codificano per proteine essenziali della cellula.

I geni ‘regolati’ dipendono dalle necessità della cellula.

Le cellule economizzano l’energia tramite la regolazione dei geni, esprimendoli solo quando servono,

I geni ‘inducibili’ sono quelli che vengono espressi grazie all’induzione da parte di un fattore esterno, che interagisce

con un sito di controllo posto sul DNA (a monte del promotore); questo fattore esterno è detto induttore e, senza di

esso, il gene non verrebbe espresso.

L’OPERONE

Si definisce operone un insieme di geni che vengono regolati in modo strettamente coordinato. L'organizzazione dei

geni in operoni è un elemento fondamentale nella regolazione genica dei procarioti: gli operoni contengono infatti,

oltre ai geni che devono essere trascritti, sequenze particolari, denominate siti di controllo, che con vari meccanismi

regolano l'espressione dei geni dell'intero operone. Gli operoni sono comuni alla maggior parte dei procarioti, ma

sono raramente trovati negli eucarioti (nematoda e pochi altri), che possiedono meccanismi di regolazione diversi.

Gli operoni vennero studiati per la prima volta nel 1961 dai biologi francesi François Jacob e Jacques Monod.

STRUTTURA DI UN OPERONE

Uno o, di solito, più geni strutturali, ovvero geni che codificano per determinati enzimi o proteine necessari

alla cellula.

un promotore, situato a monte dei geni, ovvero una sequenza di DNA che, legandosi all'RNA polimerasi,

permette l'inizio della trascrizione. L'RNA polimerasi ha infatti bisogno di riconoscere la sequenza del

promotore per iniziare il processo.

un operatore, un frammento di DNA, che può essere situato a monte, a valle o anche lontano dal promotore,

che regola l'espressione dei geni strutturali. L'operatore svolge questa funzione interagendo con una specifica

proteina chiamata proteina repressore o proteina attivatore, a

seconda che, appunto, impedisca o stimoli l'espressione.

Inoltre, l'operone può anche contenere un gene regolatore, che pure ha un suo promotore e che codifica

appunto per la proteina regolatrice.

Tuttavia, a volte, questo gene non viene normalmente considerato parte integrante dell'operone, in quanto

in alcuni casi può essere dislocato in un punto del genoma anche molto lontano dall'operone stesso.

L’operone lattosio e Escherichia Coli

L’operone lattosio, o operone lac, è l’operone dell’Escherichia Coli e fu il primo a essere studiato.

L’Escherichia Coli è un batterio capace di crescere in un terreno minimo che contiene sali e una fonte di carbonio

come il glucosio. Queste sostanze chimiche possono essere modificate dalla macchina enzimatica della cellula per

produrre qualsiasi cosa la cellula abbia bisogno per crescere e riprodursi, come ad esempio gli acidi nucleici, le

proteine e i lipidi. L’energia per queste reazioni biochimiche nella cellula deriva dal metabolismo del glucosio, un

processo che è di importanza centrale nel funzionamento di una cellula batterica e delle cellule di tutti gli organismi.

Gli enzimi richiesti per il metabolismo del glucosio sono codificati da geni costitutivi.

Se a E.Coli viene fornito come fonte di carbonio il lattosio, invece del glucosio, viene immediatamente sintetizzato un

determinato numero di enzimi, necessari per metabolizzare questo zucchero.

L’analisi ha dimostrato che quando il lattosio (glucosio+galattosio) è l’unica fonte di carbonio nel terreno di crescita

vengono sintetizzate tre proteine: 1 2

1. -Galattosidasi: ha principalmente due funzioni, catalizzare la scissione del lattosio nei due monosaccaridi e

catalizzare la conversione del lattosio in allolattosio, una diversa forma del lattosio, importante nella regolazione

dell’espressione dei geni per l’utilizzo del lattosio.

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Controllato dal gene LacZ.

2. Lattosio permeasi (o proteina M): si trova nella membrana dell’Escherichia Coli ed è necessaria per il trasporto

attivo del lattosio nel terreno di coltura all’interno della cellula.

Controllato dal gene LacY.

3. Transacetilasi: è una proteina, la cui funzione è poco chiara.

Controllata dal gene LacA.

Ceppo con terreno minimo con glucosio ma non lattosio: vengono prodotte solo poche molecole di ciascuna delle tre

proteine, indicando che il livello dei geni che esprimono queste tre proteine è basso.

Ceppo con terreno minimo con lattosio ma non glucosio: il numero di molecole delle tre proteine aumenta di circa

mille volte, cioè perché i tre geni che esprimono le tre proteine sono attivamente trascritti e tradotti, mentre prima

erano inattivi. - - -

Lo studio dei tre geni e la loro mappatura furono possibili grazie alle mutazioni (LacZ , LacY e LacA )..

1. La mutazione del gene lacZ non solo portava alla perdita della funzione della -galattosidasi, ma anche alla perdita

delle altre due attività.

2. La mutazione del lacY determinava la non funzionalità della permeasi e l’assenza di attività transacetilasica, ma non

alteravano l’attività della galattosidasi.

3. La mutazione lacA, infine, non mostravano attività transacetilasica, ma le altre due.

Questo tipo di attività, che mostra effetti polari, sono chiamate mutazioni polari.

NB: Bisogna sempre tener presente che nei batteri trascrizione e traduzione sono processi strettamente correlati;

l’RNA Polimerasi inizia la trascrizione in direzione 5’ 3’ e non appena è stata sintetizzata la porzione 5’ dell’mRNA, i

ribosomi si attaccano alle sequenze specifiche e danno inizio alla traduzione. Quindi man mano che la trascrizione

procede, l’mRNA si trova a essere coperto per tutta la sua lunghezza dai ribosomi. L’effetto polare di mutazione non

senso è dovuto a prematura interruzione della traduzione di un gene, con conseguente rilascio dei ribosomi (STOP).

Dallo studio fu possibile stabilire che i tre geni erano geni strettamente concatenati l’uno con l’altro ed erano posti nel

seguente ordine: LacZ, LacY, LacA

Sempre dalle loro mutazioni fu possibile determinare che i tre geni vengono trascritti su un'unica molecola di mRNA,

chiamata mRNA poligenico o mRNA policistronico e non su tre mRNA separati.

I: LacI, gene regolatore

p1: CAP

P2: Promotore dell’operone

o: LacO, gene operatore

z, y, a: LacZ, LacY, LacA

Mutanti nella regolazione

Jacob e Monod isolarono un certo numero di mutanti nei quali tutti i prodotti genici dell’operone lattosio venivano

sintetizzati in modo costitutivo, cioè tutte e tre le proteine erano sintetizzate sia in presenza sia in assenza di lattosio.

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Jacob e Monod ipotizzarono che questi fosssero mutati nel sistema di regolazione, cioè nel meccanismo responsabile

della normale espressione dei geni che codificano per gli enzmi.

Come risultato degli esperimenti trovarono due classi di mutanti costitutivi: una classe mappava in una regione

relativamente piccola di DNA, adiacnte al gene lacZ, che essi chiamarono operatore (lacO).

L’altra classe mappava a una certa distanza, in una regione di DNA di estensione tipica di un gene, chiamato lacI o

gene del repressore lac.

Mutanti nell’operatore: C

Le mutazioni nell’operatore furono chiamate mutazioni operatore-costitutivo o lacO .

C

Tutti i mutanti lacO sintetizzano gli enzimi per l’utilizzo del lattosio sia in presenza, sia in assenza del lattosio

stesso.

Attraverso l’uso di ceppi parzialmente diploidi (come il ceppo F, vedi coniugazione batteri), Jacob e Monod

poterono definire meglio il ruolo dell’operatore nella regolazione dell’espressione dei geni lac.

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