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MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

La microscopia a fluorescenza permette di osservare la localizzazione di certe molecole dette fluorocromi o fluorofori che assorbono radiazioni di lunghezza d'onda inferiore e rilasciano parte dell'energia sotto forma di luce visibile con lunghezza d'onda maggiore, attraverso il fenomeno della fluorescenza. La sorgente di luce del microscopio produce un fascio di luce (a tutte le lunghezze d'onda, inclusa UV) che passa attraverso un particolare sistema di filtri che impediscono il passaggio a tutte le lunghezze d'onda tranne quelle che eccitano un fluorocromo specifico.

CONTRASTO: la fluorescenza offre un elevato contrasto, ad esempio si usa per fare osservazioni su intere cellule e componenti cellulari evidenziati su uno sfondo nero o su sezioni spesse di tessuto, che non possono essere osservate con il microscopio ottico.

SPECIFICITÀ: posso legare sostanze fluorescenti a specifiche proteine, molecole o comparti cellulari sia di cellule...

vive che perché i diversi piani focali interferisconofissate. con i raggi luminosi). Il Microscopio-QUANTITATIVA; posso calibrare il sistema, e le aree dove c’è Confocale produce l’immagine di un sottileDEFINIZIONE PERCORSO OTTICO MICROSCOPIO ELETTRONICOun segnale di fluorescenza maggiore sono quelle in cui ho PHOTOBLEACHING O MICROSCOPIO CONFOCALE A piano all’interno di un preparato dimaggiore quantità di molecola, proteina o sostanza a cui ho spessore assai maggiore. In questoFOTODECOMPOSIZIONE SCANSIONE LASERlegato lo specifico fluorocromo microscopio il campione è illuminato daBLU; DAPI legato al DNA FLUORESCENZA NATURALE FLUORESCENZA SECONDARIA A TRASMISSIONE A SCANSIONE un raggio laser focalizzato che passaROSSO; anticorpo fluorescente legato ai centromeri rapidamente attraverso il campione adVERDE; anticorpo fluorescente (FITC) legato ai microtubuli una determinata profondità, illuminandoÈ uno dei principali

Problemi che si verificano durante la fluorescenza naturale (autofluorescenza).

La fluorescenza secondaria è quella indotta da una colorazione con coloranti fluorescenti detti fluorocromi all'interno dell'oggetto.

I microscopi elettronici sono costituiti da una colonna cilindrica alta e cava utilizzano elettroni per l'osservazione delle immagini in fluorescenza.

Al contrario, i microscopi elettronici a scansione (SEM) utilizzano soltanto un sottile piano «sezione ottica».

SORGENTE LUMINOSA. Lampade al mercurio o LED.

FILTRO DI ECCITAZIONE. Lascia passare solo la luce di lunghezza d'onda opportuna per l'eccitazione.

Fenomeno per cui una molecola fluorescente perde la sua fluorescenza. Tanto più a lungo e intensamente osserviamo una sostanza fluorescente, tanto più a lungo e intensamente vengono riemessi dalla superficie del campione.

Nel tessuto possono essere presenti sostanze fluorescenti come vitamina A, riboflavina, porfirine, clorofille.

raggio di elettroni. La parte superiore della SEM l'immagine è formata dagli elettroni

SPECCHIO DICROICO. Riflette la luce di eccitazione che passa immagine in fluorescenza, tanto prima la fluorescenza decadelipofuscine) che vengono identificate sulle colonna contiene un sottile filamento di che sono riflessi dal campione o daattraverso l'obiettivo e arriva al campione; La fluorescenza e l'immagine diventa scura.sezioni di tessuti con l'osservazione delle TUNGSTENO che se riscaldato agisce elettroni secondari emessi dal campionepassa attraverso l'obiettivo e arriva allo SPECCHIO DICROICO che METODI PER LIMITARE QUESTO FENOMENO:loro tipiche fluorescenze. come SORGENTE DI ELETTRONI. Gli quando viene colpito dal raggio primarioquesta volta si lascia attraversare dalla luce emessa. ridurre l'intensità luminosa elettroni strappati dal filamento di elettroni. Gli elettroni colpiscono ilFILTRO DI EMISSIONE. Blocca tutta la luce emessa

tranne la - ridurre il tempo di esposizione (apro lo shutter solo quando sono incandescente vengono accelerati dentro campione non sezionato, che producefluorescenza emessa dal campione. pronta per l’osservazione) alla colonna, in cui viene prodotto il vuoto elettroni secondari che vengono raccoltiCUBO o BLOCCHETTO. Contiene in una stessa unità lo specchio - aumento la concentrazione dei fluorocromi (se l’aria non fosse rimossa, gli elettroni si da uno schermo che, integrando glidicroico, il filtro di eccitazione e di emissione. - utilizzo fluorocromi meno suscettibili alla fotodecomposizione disperderebbero per collisione con le impulsi provenienti da tutte le direzioni,APPLICAZIONE: - posso sfruttare il fenomeno per azzerare molecole di gas). Così come i raggi di luce producono un’immagine in bianco e nerol’autofluorescenza di un campione possono essere focalizzati da una lente della struttura esterna tridimensionale deldi vetro, un fasciotag html appropriato. Ecco il testo formattato:

Di elettroni, con carica campione negativa, possono essere focalizzati da lenti elettromagnetiche poste nelle pareti della colonna. L'immagine che arriva all'osservatore deriva dagli elettroni che sono passati attraverso il campione e che sono stati messi a fuoco su uno schermo posto alla base della colonna.

METODI IMMONOLOGICI parte 2

DEF: Si basa sull'utilizzo di Anticorpi marcati con un marcati con Fluorocromi o coniugati con Enzima (generalmente la perossidasi o la fosfatasi Enzima alcalina), che catalizza la reazione in cui un substrato IF o IIC diretta incolore viene convertito in un prodotto colorato.

ANTICORPO PRIMARIO

Saggio effettuato su piastre da microdosaggio Anticorpo Primario

Uno dei componenti (antigene o anticorpo) adeso al IF: FLUOROCROMO substrato della piastra, la reazione di legame IIC: ENZIMA (perossidasi, fosfatasi) antigene-anticorpo risulta essere immobilizzata e Substrato prodotto colorato pertanto facilmente evidenziata attraverso l'aggiunta di un

substrato specifico che reagendo con l’enzima IF o IIC indirettaconiugato produrrà una colorazione che verrà poi Anticorpi Secondariletta con un colorimetro. marcati con Fluorocromi o coniugatiAnticorpo Secondario con Enzimi- Industria farmaceutica (fasi di IIC: ENZIMA (perossidasi, fosfatasi)screening di molecole Substrato prodotto coloratofarmaceutiche IF: FLUOROCROMOpromettenti)- Analisi cliniche WESTERN BLOTTING- Industria alimentare (ricerca di Questa tecnica combina la risoluzione dell’elettroforesi con latossine nel cibo) sensibilità della rivelazione immunochimica. Le bande proteiche- Ricerca scientifica ELISA IIC e IIFAPPLICAZIONI separate mediante elettroforesi vengono trasferite dal gel ad unaCLIA (ChemiLuminescent- DETERMINA LA PRESENZA E membrana immobilizzante e poi trattate con unCONCENTRAZIONE DI UN ImmunoAssay) ANTICORPO MARCATO, specifico per la proteina d’interesse, la cuiANTIGENE banda viene quindi riconosciuta. Le proteine

devono essere trasferite dal gel alla membrana mantenendo la forma e il livello di- DETERMINA LA PRESENZA E diffusione acquisiti alla fine della prima separazione elettroforetica.

CONCENTRAZIONE DI UN ANTICORPO NEL CAMPIONE DA TESTARE

Il trasferimento (blotting) delle proteine dal gel su un foglio di nitrocellulosa si ottenere mediante elettroblotting (il campo elettrico usato per il trasferimento deve essere orientato perpendicolarmente alla superficie del gel per far muovere le proteine dal gel verso la membrana che si trova tra la superficie del gel e l’elettrodo positivo)

METODO COMPETITIVO Metodo ELISA per la titolazione di un antigene

METODO DEL DOPPIO ANTICORPO(sandwich) • Metodi sensibili per la localizzazione di specifiche proteine o polisaccaridi nei tessuti

LETTURA DELLE PIASTRE • Sfruttano il riconoscimento specifico ANTIGENE ANTICORPO

IIC: anticorpi coniugati con enzima perossidasi (rivelato poi da una reazione istochimica)

(microscopio ottico)• IF: anticorpi coniugati con fluorofori (microscopio a fluorescenza)

METODI IMMUNOLOGICI

parte 1

DEF: insieme di elementi cellulari il cui ruolo è quello di intervenire nel riconoscimento e nella eliminazione di strutture estranee all'organismo (non-self), riconoscendone l'antigene. Questi elementi cellulari sono diversi per natura e per funzione, sono sparsi in tutto il corpo. Le cellule fondamentali di questo sistema sono i LINFOCITI che circolano costantemente nell'organismo, nel sangue, nella linfa (TESSUTO CONNETTIVO FLUIDO CHE SCORRE NEI VASI LINFATICI; Composta da -LIQUIDO INTERSTIZIALE -LINFOCITI - MACROFAGI DI DIVERSO TIPO) e negli organi linfatici cellule coinvolte nella risposta immunitaria cellulare o cellulo-mediata, hanno una ipersensibilità ritardata e producono LINFOCHINE (sostanze attivatrici prodotte dai linfociti stessi o da altre cellule), raggiungono la completa maturazione nel timo. La reazione cellulo-mediata avviene

mediante il contatto diretto dei linfociti T con l'antigene LINFOCITI Testraneo, anche senza la produzione d'anticorpi da parte dei linfociti B. Prevede l'attivazione dei macrofagi, delle cellule natural killer, dei linfociti T e la produzione di EMATOSSILINA antigeni specifici a qualcosa di tossico per le cellule (citotossicità), nonché il rilascio di EOSINA varie citochine in risposta ad un antigene. SISTEMA IMMUNITARIO REAZIONI DI AGGLUTINAZIONE COLORAZIONI PRODUZIONE ANTICORPI IN REAZIONI DI H&E sono coinvolti nella risposta immunitaria umorale, LABORATORIO IMMUNOPRECIPITAZIONE sintetizzano immunoglobuline o anticorpi in risposta LIPOFUSCINA al riconoscimento di un antigene, solitamente E' un fenomeno dovuto all'aggregazione e alla B HELPER sotto il controllo delle cellule T (raggiungono il sedimentazione completo differenziamento nel midollo di un antigene dopo reazione con l'anticorpo. A PRIMARIO A SECONDARIO In opportune condizioni laDiffusione monodimensionale semplice.osseo). La risposta immunitaria umorale è importante - diretta: se l'antigene è corpuscolato (cellule, complesso antigene-anticorpo da Diffusione monodimensionale doppia.soprattutto nella difesa contro le infezioni batteriche. batteri) luogo ad una reazione di precipitazione; Tecniche di diffusione bidimensionale.Hanno sensibilità sufficiente per molte essendo le molecole di anticorpo Tecniche di immunodiffusione radialeL'anticorpo PRIMARIO è l'anticorpo diretto sono una sottopopolazione di cellule correlate ai linfociti che applicazioni diagnostiche: ambivalenti, e contenendo l'antigene 2 o singola.contro l'antigene di interesse e vengono riconoscono ed uccidono cellule infettate e/o danneggiate - Nell'individuazione del gruppo sanguigno: più epitopi, si ottengono precipitati Immunoprecipitazione in fase liquida.prodotto per immunizzazione di unsecernendo citochine

inñammatorie;