Schemi integrati con slide di biologia molecolare

COLTURE CELLULARI

Delle cellule precedentemente appartenenti un organismo umano, vegetale o animale sono modificate

affinchè possano crescere in plastica o vetro. Nel corpo= in vivo; nella plastica in vitro. Sono tenute in un

incubatore che le mantiene a T corporea. Le cellule potrebbero comportarsi in vitro similemnte a come si

comportano in vivo, potrebbero produrre le stesse proteine.

Le cellule possono essere usate per testare i farmaci, osservare dinamiche patologiche, osservare il processo

rigenerativo e osservare i processi di sviluppo.

Mezzo di coltura: DMEM, Dulbecco Modified Eagle’s Media. Contiene glucosio, proteine e Sali essenziali. Contiene un indicatore

di pH, il rosso fenolo. Il media è rosso/rosa a pH 7.2. (acido>giallo o arancione, crescita cellulare e di batteri; basico >viola,

nessuna crescita) Possono esserci antibiotici (penicillina e streptomicina) per prevenire la contaminazione batterica, Sali e buffer

che simulano l’ambiente in vivo e il siero.

Tripsina EDTA: enzima usato per staccare le cellule da una piastra di coltura. Lega gli ioni calcio del medium

che normalmente inibirebbero la tripsina.

Buffer Fosfato salino: utilizzato per lavare o rimuovere il siero in eccesso, che inibisce la funzione della tripsina.

Transfezione: metodo che permette il trasporto di DNA, RNA e/o varie macromolecole all’interno di una cellula eucariotica

attraverso metodi di natura chimica, lipidica o fisica. Si ha l’introduzione di DNA in cellule di mammiferi. La trasfezione è il

processo di introduzione di materiale biologico esogeno in cellule eucariotiche e nella gran parte dei casi di mammifero. È più

frequente l'inserimento di materiale genetico, tra cui solitamente DNA e siRNA, ma, in generale, possono essere trasfettate anche

proteine (come ad esempio anticorpi). Il processo e i metodi per attuarlo sono analoghi a quelli per la trasformazione batterica,

che però riguarda batteri e, talvolta, le cellule vegetali. Il processo di trasfezione può essere fatto:

in vitro - su cellule bersaglio in colture cellulari a lungo termine;

ex vivo - su cellule isolate da un organismo e trasferite su terreno di coltura;

in vivo - direttamente su cellule di un organismo. 46 |

La trasfezione è utile in tutti gli studi di genetica e biologia molecolare che vogliano ottenere informazioni

sull'attività e la funzione di determinati geni. Questo può essere fatto, generalmente, in due modi:

sovraesprimendo il gene in questione oppure silenziandolo.

Come si inserisce il DNA?

1. Iniettandolo:

2. Forando la membrana senza lisare la cellula

3. Creando un complesso DNA più una sostanza che può entrare in cellula

Il metodo tra i più usati è la elettroporazione, che consiste nell'applicare una differenza di potenziale ai lati

della cuvetta che contiene la soluzione con le cellule e il DNA da inserire: lo shock elettrico provoca la

formazione di pori nella membrana che permettono l'ingresso del materiale genetico. Ha come difetto l'alta

percentuale (%) di cellule che non sopravvivono in seguito al trattamento.

Altro metodo è la microiniezione: l'inserimento del materiale tramite un sottile ago direttamente nella cellula.

Per ovvi motivi pratici è più frequentemente usato in clinica, in tecniche come la fecondazione artificiale, che

non in laboratorio dove si lavora con un alto numero di cellule.

Un approccio diretto alla trasfezione è poi il metodo cosiddetto del cannone genico dove il DNA è accoppiato

a un solido inerte (di solito di oro) che è "sparato" direttamente nella cellula.

Uno dei metodi più semplici e meno costosi è quello che utilizza il fosfato di calcio. La procedura prevede il

mescolamento di una soluzione tampone HEPES contenente ioni fosfato insieme a una soluzione di cloruro di

calcio (CaCl2) e il DNA da trasfettare. Il mescolamento delle due soluzioni produce un precipitato di calcio

fosfato, che andrà a legare la molecola di DNA. Il precipitato viene prelevato, risospeso e aggiunto al terreno di

coltura (di solito una coltura mono strato). Con un processo ancora non ben noto le cellule legano il

precipitato e permettono l'ingresso del DNA. La precipitazione può avvenire anche con Dietil-ammino-etil-

destrano.

Un altro metodo biologico molto efficace sfrutta i liposomi, piccole vescicole lipidiche che inglobano il DNA e

sono indotte ad entrare con esso nella cellula simulando i processi di endocitosi cellulare. Altro metodo

prevede l'uso di dendrimeri, molecole altamente ramificate che si legano al DNA e lo trasportano nella cellula.

A seconda del destino in cui incorre il vettore inserito si può distinguere tra trasfezione transiente e trasfezione

stabile. La trasfezione è transiente quando il vettore resta nella cellula come frammento extracromosomico,

cioè non si integra nel genoma cellulare; in questo caso le proprietà indotte dalla trasfezione permangono per

breve tempo, di solito scompaiono prima delle 72 ore. La trasfezione è stabile, invece, quando il DNA esogeno

si integra stabilmente nel genoma: l'effetto quindi rimane per l'intera vita della cellula e saranno trasmesse

anche alle cellule che ne derivano.

La trasfezione transiente è certamente più rapida, facile ed economica ma ovviamente permette studi limitati

nel tempo. La trasfezione stabile si ritiene necessaria ogni volta che l'effetto genico è a medio-lungo termine:

ad esempio quando si studiano geni che si ritengono connessi ai processi di differenziamento cellulare.

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Una cellula su 10 si integra stabilmente, casualmente nel genoma.

DAEA-Dextran: facilita il collegamento tra membrane cellulari e DNA e l’ingresso del DNA via endocitosi.

• DEAE-D, catione polimerico, si associa con il DNA. Il complesso si lega allora alla superficie della cellula.

DESTRANO: Polisaccaride costituito da unità di D-glucosio legate mediante legami di tipo alfa1/4 o alfa1/6.

Quando viene associato a gruppi carichi positivamente DEAE (dietilamminoetile) è in grado di legare il DNA e

di mediarne l’ingresso attraverso le membrane. Le cellule vengono trattate con glicerolo o DMSO (shock

osmotico) . è l’unico metodo per transfezioni stabili.

Elettroporazione: vengono usate scariche ad alto voltaggio per introdurre il DNA nelle cellule. il voltaggio porta

• a una rottura temporanea e alla formazione di pori. Le varianti sono l’ampiezza e la lunghezza dell’impulso

elettrico. 47 |

Nella cellula è possibile trasfettare plasmidi, RNA e siRNA.

È possibile quindi localizzare la proteina nella cellula andando a creare anticorpi o esprimendo una proteina

fusa con GFP. Nella cellula si possono ridurre i livelli di proteina, aumentarli o esprimere versioni mutanti.

SI utilizzano cellule di mammifero per le modifiche in post-traduzionali. Cellule fatte crescere in coltura liquida invece che

aderenti a un substrato Usiamo CaPi o PEI per efficienza alta Output: Ammontare che varia da milligrammo a grammo.

ANIMALI TRANSGENICI

Approcci usati per l’analisi dello sviluppo dei mammiferi:

- Osservazione nell’embriogenesi

- Analisi fenotipica di mutanti

- Clonaggio e analisi dell’espressione di geni di sviluppo

Gli organismi usati come modelli sono Arabidopsis, C. elegans, Drosophila, Xenopus, Zebrafish, Topi, ratti,

maiali, pecore, capre e mucche. Sono animali con inserito nel genoma un gene esogeno.

Knock-out mutation: Sostituzione di un segmento del genoma attraverso ricombinazione omologa che

normalmente comporta un allele non funzionante o «nullo».

Knock-in mutation–Simile alla Knock-out mutation, ma effettuata in circostanze per cui il risultato è un allele

parzialmente funzionante o non funzionante.

Trasferimento nucleare–Tecnica utilizzata per creare un «clone». Il nucleo di una cellula adulta (differenziata) è

inserito nel citoplasma svuotato di una cellula uovo. La cellula uovo riprogamma i geni della cellula adulta

affinchè si comporta come una cellula staminale totipotente

Transgeni:

1. Piccole molecole di DNA ricombinante: geni o cDNA collegati a sequenze di DNA che permettono la

corretta espressione da parte delle cellule dell’host

2. Costrutti con reporter

Un animale che ha uno o più geni di origine esogena inseriti artificialmente nel DNA delle sue cellule.

Le rane sono state tra i primi animali transgenici creati. Il DNA isolato non veniva trasferito, venivano usati solo i

nuclei. Venne stabilito così il metodo di microiniezione. L’utilizzo di questi animali porta a :

- Topi come bioreattori-sintesi di anticorpi umani

- Relazioni struttura funzione

- Topi come modelli di malattie umane

- Analisi dei meccanismi cellulari e molecolari dietro alla base della patogenesi

Un animale transgenico si crea dopo aver iniettato geni esterni nel pronucleo (solitamente maschile) di un

uovo fertilizzato o di una blastocisti, il gene è inserito random. Le uova possono essere trasferiet lo stesso

giorno (1 cellula) o il giorno dopo (2 cellule) negli ovidotti di femmina pseudogravida.

Gli animali transgenici sono solitamente incrociati a animali non transgenici .NON incrociare founders diversi.

Ogni founder è il risultato di un evento di integrazione transgenica CASUALE

I topi transgenici sono spesso utilizzati per:

1. Caratterizzare l’abilità di un promotore di dirigere l’espressione genica specifica in un tessuto Ad esempio un

promotore pu esere clonatoa monte di un gene reporter come LacZ o GFP

2. Esaminare gli effetti di geni endogeni o esogeni sovraespressi o sottoespressi in tempi e luoghi specifici

nell’animale

3. Studiare la funzione dei geni Molte malattie umane possono essere modellate introducendo la stessa

mutazione nel topo. L’animale intatto provvede una visione più completa e più fisiologicamente rilevante della

funzione di un transgene nel testing in vitro 48 |

I topi non possono essere infettati con la poliomielite. Non hanno il recettore per l’entrata del virus L’uomo invece ha questo

recettore Topi transgenici che esprimono il gene umano per il recettore per la poliomielite possono essere infettati con il virus e

possono sviluppare paralisi ed sviluppare tratti patologici caratteristici della malattia nell’ uomo

REPLICAZIONE La replicazione del DNA avviene in modo semiconservativo. L’uso del DNA come stampo è il prcoesso in cui la

sequenza nucleotidica di un filamento di DNA viene copiata mediante appaiamento complementare delle basi

in una sequenza complementare di DNA. Il processo comprende il riconoscimento di ciascun nucleotide nel

filamento stampo di DNA da parte di un nucleotide complementare e richiede la separazione dei due filamenti

dell’elica del DNA. Questa separazione espone i gruppi donatori e accettori di legami idrogeno su ciascuna

base del DNA per l’appaiamento delle basi con l’appropriato nucleotide libero in arriv