Schemi integrati con slide di biologia molecolare

Scoperta DNA pol: Kornberg, l’enzima è fatto reagire in presenza di molecule di DNA che contengono

diverse quantità di coppie di basi. In ciascun caso il prodotto sintetizzato aveva lo stesso rapporto di

basi del DNA stampo. Sthal e Meselson condussero un esperimento in cui separarono le molecole

neosintetizzate di DNA e dimostrarono che due filamenti si separano definitivamente durante la

replicazione.

Dogma centrale: il DNA è lo stampo per la sua autoreplicazione. La sintesi di RNA mediante

trascrizione è diretta da uno stamo di DNA. La sintesi di proteine, quindi la traduzione, è diretta da

uno stampo di RNA. La sequenza dell’RNA non è mai determinata da un stampo proteico , ne si può

pensare che il DNA venga prodotto da uno stampo di RNA.

LEGAMI CHIMICI Un legame chimico rappresenta una forza d’attrazione che tiene uniti gli atomi. Aggregati atomici di

dimensioni definite vengono chiamati molecole. I legami forti non vengono quasi mai distrutti alle

temperature fisiologiche, i legami deboli vengono rotti facilmente e diventano stabili solo quando

sono disposti in gruppi ordinati. Il numero massimo di legami covalenti che un atomo può formare

viene detto valenza. I legami covalenti si formano quando gli elettroni vengono condivisi tra gli atomi

di una molecola. L’angolo che si forma tra due legami convergenti su un singolo atomo è chiamato

anglo di legame. È approssimativamente sempre lo stesso. i legami differiscono anche per la libertà di

rotazione.

I legami più deboli sono quelli di van der Waals. Quasi tutte le molecole formano un numero di

legami deboli molto vicino al numero degli atomi che le compongono. Tutte le molecole sono in

grado di formare legami van der Waals, mentre per quelli idrogeno o ionici è necessaria una carica.

La separazione delle cariche elettriche può essere permanente o temporanea, a seconda degli atomi

coinvolti. Se il centro della carica positiva non si sovrappone a quello della carica negativa, ci troviamo

di fronte a un dipolo elettrico. Molecole come l’acqua che hanno le caratteristiche del dipolo vengono

chiamate molecole polari.

Van der Waals: legami determinati da forze di attrazione non specifiche, si creano quando due atomi

si avvicinano l’uno all’altro. Non si ha una separazione di carica permanente ma una fluttuazione

indotta dalla vicinanza. Possono crearsi in tutti i tipi di molecole. Può esistere una repulsione dovuta

alla sovrapposizione degli elettroni sul guscio più esterno. I legami si bilanciano a una distanza definita

raggio di vdW. Alle temperature fisiologiche rappresentano un’effettiva forza di legame solo quando

un numero elevato di atomi interagisce con altrettanti atomi di un’altra molecola. Queste forze sono

dovute al fatto che la distribuzione di carica elettronica varia. Perché possa avvenire la conformazione

molecolare deve garantire la distanza adeguata e interazioni steriche ben precise. Sono interazioni

specifiche ma reversibili.

Legami idrogeno: un legame idrogeno si forma tra un atomo di idrogeno donatore (carica +) e un

accettore di idrogeno (carica-). È un caso particolare di interazione tra dipoli. I legami più forti sono

quelli con una maggiore diferenza di carica tra atomi donatori e accettori. Sono più deboli dei

covalenti. La distanza tra gli atomi è inferiore al raggio di vdw ma superiore a quella dei covalenti. I

legami idrogeno sono direzionali e richiedono l’esistenza di molecole con gruppi accettori/donatori.

Hanno un massimo energetico quando si ha un allineamento. Sono importanti per interazioni

specifiche ma reversibili e sono rilevanti se numerosi. Conferiscono specificità.

Legami ionici: molte molecole organiche possiedono gruppi ionici che contengono una o più cariche

nette positive o negative. Queste cariche sono neutralizzate da gruppi dotati di una carica opposta e

che si trovano nelle vicinanze.

I legami deboli si creano solo quando le superfici interagenti possono avvicinarsi l’una all’altra. Ciò è

possibile quando possiedono una struttura complementare. Per esempio alcune molecole polari

contengono adeguati atomi accettori.

La struttura specifica di una soluzione è influenzata dalle molecole presenti perché le molecole

differiscono per il tipo di legami secondari che possono instaurare. 1 |

Interazioni idrofobiche: le molecole idrofobiche tendono a raggrupparsi escludendo l’acqua e

formando strutture sferiche. I legami sono importanti sia per stabilizzare la struttura delle proteine sia

per la formazione di complessi tra proteine e altre molecole. Le interazioni guidano la formazione

della doppia elica, con le basi aromatiche all’interno e lo scheletro zucchero fosfato polare esposto

all’acqua.

I legami deboli sono il mezzo necessario affinché gli enzimi si leghino al loro substrato. Permettono

un corretto posizionamento delle proteine sulle molecole di DNA e RNA. Le interazioni tra proteine e

DNA e proteine/proteine sono alla base dei meccanismi con i quali le cellule recepiscono i segnali e

rispondono ad essi. (ricorda che le proteine possono interagire con il DNA in diversi modi: mediante

riconoscimento di sequenze di basi o di conformazioni della doppia elica.)

Ogni specifica molecola ha una propria energia libera, la disparità è data dal fatto che i legami

covalenti hanno diverse energie di legame.

Tutti i processi degradativi hanno due scopi: 1) la produzione di precursori per la sintesi di altre

molecole organiche e 2) la conservazione di una parte di dell’energia libera della molecola degradata

in una forma utilizzabile per le attività cellulari. Alcuni passaggi sono accoppiati alla sintesi di molecole

ad alta energia. L’ATP è la molecola ad alta energia più importante. I legami la cui idrolisi porta a

elevati valori negativi sono detti legami ad alta energia. Molti processi biosintetici sono il risultato di

reazioni accoppiate: la prima fornisce energia facendo in modo che la seconda avvenga in modo

spontaneo. Sono sempre reazioni di trasferimento di gruppo in cui le molecole si scambiano gruppi

funzionali. Tutte le reazioni portano al rilascio di P∽P che viene scisso. La sintesi dell’ATP ha un ruolo

fondamentale nell’accumulo controllato di energia nelle molecole che fungono da donatori di energia.

Il ruolo sfrutta la presenza nella molecola di due legami ad alta energia la cui rottura rilascia gruppi

specifici.

Entrambi i tipi di acidi nucleici vengono sintetizzati a partire da monomeri mono-nucleotidici, detti

nucleosidi fosfati. L’energia libera per la sintesi degli acidi nucleici deriva dall’idrolisi del gruppo

pirofosfato ad alta energia.

STRUTTURA DEL DNA Il DNA è formato da due catene polinucleotidiche avvolte l’una sull’altra nella forma a doppia elica.

Esso codifica per l’informazione ereditaria e per l’informazione per il mantenimento delle funzioni

cellulari. Il costituente fondamentale è il nucleotide e consiste di un fosfato legato ad uno zucchero

(2’deossiribosio) a cui è attaccata una base azotata. Da un punto di vista chimico le basi azotate sono

dei composti eterociclici aromatici, ovvero composti ad anello che presentano uno o più atomi diversi

dal carbonio.

Lo zucchero unito alla sola base forma il nucleoside. Il nucleotide è formato quindi mediante la

formazione di un legame glicosidico fra la base e lo zucchero e un legame fosfodiesterico tra base e

l’acido fosforico. I nucleotidi possono portare il gruppo fosfato in posizione 5’ o 3’. I nucleotidi sono

legati tramite legami fosfodiesterici in cui il fosforo tra due è unito a uno zucchero esterificato

mediante l’ossidrile 3’ e un secondo con il 5’. Il legame crea un’impalcatura ripetitiva zucchero-fosfato

che è caratteristica costante del DNA. I legami fosfodiesterici conferiscono una polarità alla catena,

determinata dall’asimmetria dei nucleotidi e dal modo in cui sono legati. Le basi del DNA sono anelli

eterociclici planari e possono essere purine o pirimidine.

Watson/Crick: individuarono la configurazione più favorevole e stereochimicamente compatibile con i

dati di diffrazione ai raggi X precedenti. Nella doppia elica, le due catene di DNA sono tenute unite da

legami idrogeno tra coppie di basi su filamenti opposti. Nella foto a raggi X le linee di diffrazione che

si uniscono al centro sono indice di una struttura elicoidale. Le regioni scure mostrano che le basi

sono impilate regolarmente a una distanza di 3.4 Å e perpendicolari all’asse dell’elica. 2 |

I due filamenti avvolti tra loro suggerivano che un filamento servisse da superficie specifica stampo

sula quale si formava l’altro.

La regola di Chargaff. Il rapporto dei quattro nucleotidi varia da specie a specie. Il rapporto relativo

delle quattro basi non è casuale, il numero di residui di Adenina è uguale a quello della Timina, così

come il numero di Guanina è uguale alla Citosina. Il rapporto purine-pirimidine era sempre uguale a 1.

La doppia elica è composta da due catene polinucleotidiche che sono allineate secondo un

orientamento opposto. Le due catene interagiscono grazie agli appaiamenti tra le basi. La precisione

nell’applicazione della regola di Watson e Crick è imposta sia dalla forma sterica delle basi che dalla

possibilità di formare legami idrogeno tra A:T e G:C. una coppia G:C possiede 3 legami. Un’importante

caratteristica della doppia elica è che le due coppie di basi hanno esattamente lo stesso ingombro

trasversale. (distanza tra C1’ costante per entrambi gli appaiamenti).

Le coppie di basi possono impilarsi l’una sull’altra rimanendo all’interno dell’impalcatura degli

zuccheri-fosfati.

I legami idrogeno tra le basi sono una caratteristica fondamentale della doppia elica, contribuendo

alla stabilità termodinamica dell’elica e alla specificità delle coppie di basi. Ci sono quindi fattori che

stabilizzano la doppia elica di DNA:

1. Legami idrogeno tra le basi

2. Interazioni di impilamento tra le basi: le basi sono insolubili e planari e tendono a impilarsi perpendicolarmente all’asse

longitudinale della doppia elica. Le interazioni fra le nuvole elettroniche contribuiscono alla stabilità, a causa dei dipoli

indotti transienti definiti attrazione di van der Waals.

3. Interazioni idrofobiche tra le basi: le superfici idrofobiche sono nascoste all’interno della doppia elica riducendo al

minimo l’esposizione all’acqua e quindi abbassando l’energia libera della doppia elica.

Ci sono fattori che destabilizzano la struttura come la possibile repulsione dovuta alle cariche negative

dei gruppi fosfato. Le cariche negative sono neutralizzate da cariche positive o attraverso interazioni

elettrostatiche con residui di proteine basiche. Il DNA è quindi una struttura dotata di elevata stabilità.

I livelli energetici della doppia elica favoriscono l’appaiamento di ciascuna base di un filamento con la

base complementare dell’altro. A volte però le basi possono protrudere dalla doppia elica con il base

flipping. Ci sono allora enzimi che metilano le basi o le rimuovono direttamente.

L’angolo formato dalla protrusione dei due zuccheri dalle coppie di basi è di circa 120° e 240°, come

risultato si forma un solco maggiore e un solco minore. I bordi di ciascuna coppia di basi si affacciano

nei solchi creando un sistema di donatori e accettori di legami idrogeno. ( A accettore di legame, D

donatore, M gruppo metilico e H idrogeno non polare). Il solco minore per le sue dimensioni ha

ridotte capacità di accogliere gruppi laterali di aa. Il solco maggiore è di 22Å mentre il minore di



12Å.

FORMA B Forma del DNA più comune in vivo. Si trova in una soluzione ad alto grado di umidità e contiene 10

coppie di basi per giro d’elica. Ha un ampio solco maggiore un minore pià stretto. Presenta due

filamenti che si avvolgono intorno ad un asse comune in senso destrorso. La basi occupano la parte

centrale e lo scheletro zucchero-P si trova all’esterno limitando l’effetto repulsivo dei gruppi fosfato.

La distanza tra le coppie di basi è di 3.4Å e la rotazione dell’elica per ogni coppia di basi è 36°.

L’inclinazione delle basi è di 6°.

FORMA A La forma A si osserva in soluzione a basso contenuto d’acqua, ha 11 coppie di basi per giro d’elica e il

solco maggiore è più stretto rispetto alla forma B. la forma A si trova maggiormente in

corrispondenza di complessi DNA-proteine. Le basi sono inclinate rispetto all’asse della doppia elica di

circa 20° (angolo di TILT). In questa forma è presente un foro centrale. Alcuni esempi sono i complessi

DNA proteine e gli ibridi DNA:RNA e dsRNA.

FORMA Z 3 |

Il DNA Z è un’elica sinistrorsa con un’impalcatura con andamento a zigzag. L’analisi di diffrazione ai

raggi X ha mostrato un corto DNA ricco in CG in condizioni di elevata salinità. Non è osservato in vivo,

è levogiro e presenta 12 coppie di basi per giro d’elica. Il diametro è di 18Å e l’angolo di tilt è 9°.

Caratteristico dei tratti purina-pirmidina alternati. Si trova in strutture transienti (per scaricare super

avvolgimento negativo). Vi sono proteine che legano DNA Z con grande specificità e sono importanti

per la virulenza di alcuni poxvirus(Virus vaccino e del vaiolo). Si ha la presenza di anticorpi anti DNA-

Z in malattie autoimmuni (lupus eritematoso).

Nella configurazione destrorsa il legame glicosidico è sempre nella forma anti, mentre nella forma

sinistrorsa vi sono delle fondamentali ripetizioni di dinucleotidi purine-pirimidine.

I filamenti complementari possono separarsi quando una soluzione di DNA viene scaldata oltre la

temperatura fisiologica (100°) o a elevato pH. Questo processo viene definito denaturazione ed è

reversibile. La possibilità di rinaturare permette la formazione di molecole ibride artificiali

semplicemente abbassando la temperatura di DNA denaturato. Allo stesso modo si possono formare

ibridi mescolando DNA e RNA. La capacità viene detta reazione di ibridazione.

Alcune coppie di basi adiacenti (per es. A-T/A-T), non essendo perfettamente parallele, introducono

piccoli piegamenti della molecola duplex; se tali perturbazioni sono distribuite in maniera casuale

lungo la molecola di DNA, risultano in una struttura un po’ irregolare ma sostanzialmente dritta. Se la

sequenza nucleotidica è tale per cui i piccoli angoli tra le coppie di basi adiacenti si ripetono

regolarmente a ogni giro di elica (cioè ogni 10 pb), gli angoli si sommano tra loro e risultano in una

curvatura intrinseca della molecola di DNA.

TOPOLOGIA Il DNA è una molecola flessibile; i parametri strutturali che lo caratterizzano sono in funzione sia delle

condizioni ioniche dell’ambiente sia della natura delle proteine che interagiscono con esso. Quando

le estremità sono legate il numero di volte che un filamento gira attorno all’altro non varia e si tratta di

un cccDNA ( DNA circolare covalentemente chiuso).

Il numero di volte che un filamento deve essere fatto passare attraverso l’altro afinchè le due catene

possano separarsi l’una dall’altra viene indicato come linking number.

bromuro di etidio è un intercalante che modifica la topologia del DNA. È una molecola idrofobica

il

planare che si intercala tra le coppie di basi della doppia elica cambiandone in vari modi la topologia:

la doppia elica si allunga, il twist diminuisce e diminuisce il superavvolgimento.

Il linking number è la somma di due componenti: il twist e il writhe. Il twist è il numero di volte che un

filamento gira attorno all’altro. Essendo il cccDNA non planare, presenta tensioni torsionali che

impongono all’asse di incrociarsi. L’incrocio viene definito writhe. Può presentarsi in due forme: (1)

plectonemico in cui l’asse longitudinale è avvolto su se stesso o (2) toroide in cui l’asse è avvolto come

attorno a un cilindro. Il Lk = Tw + Wr

Il superavvolgimento negativo si ha quando i superavvolgimenti sono nella direzione opposta

dell’avvolgimento della doppia elica di DNA. Se srotolato, causa una parziale separazione degli strand

dell’elica. Il positivo invece è nella stessa direzione dell’elica e se srotolato determina che l’elica si

super avvolta. Il super avvolgimento è una forma di immagazzinamento di energia libera (-9kJ).

L’energia libera contenuta in una molecola super avvolta può indurre transizioni strutturali. Una

molecola cccDNA può scaricare la tensione torsionale in varie maniere: il duplex si può denaturare

localmente (preferenzialmente in regioni ricche A:T); se sono presenti sequenze ripetute e invertite, si

può avere la formazione di strutture cruciformi; se sono presenti tratti con alternanza

purina/pirimidina il DNA può assumere la struttura Z.

Topoisomerasi: enzimi in grado di introdurre una rottura del singolo o doppio filamento del DNA in modo

temporaneo per variare il linking number. Possono essere divise in due classi principali: le

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topoisomerasi di tipo II permettono di variare il numero di legame topologico di due unità per volta.

Determinano una rottura dei due filamenti attraverso la quale fanno passare un tratto di elica integro,

prima che il taglio sia risaldato. Le topoisomerasi di tipo I permettono di cambiare il numero di

legame un’unità per volta. Esse producono rotture temporanee a singolo filamento, consentendo in

questo modo al filamento integro di passare attraverso la rottura dell’altro. Non richiedono ATP, a

differenza del tipo II.

Il taglio della molecola di DNA avviene quando un residuo di tirosina attacca un legame

fosfodiesterico dell’impalcatura della molecola di DNA bersaglio. Questo attacco causa una rottura e

la topoisomerasi rimane attaccata tramite legame covalente.

Il DNA può essere risaldato semplicemente invertendo la reazione: il gruppo OH esistente all’estremità

de