Ecotossicologia - saggio in fase solida Microtox M500

Oggi, questo protocollo, modificato da Microbics Corporation e Bulich et al. per

migliorare la rappresentatività del campione e la precisione del test, e nominato

Microtox test fase solida (SPT), è stato proposto da Azur Ambientale come

standard per testare campioni solidi.

- Il protocollo di Microtox SPT consente una valutazione della tossicità del sedimento

risospeso: nel test batteri luminescenti possono avere contatto con sostanze tossiche

sia sulle superfici di particelle sia disciolte in acqua.

- La procedura del test può essere influenzata dai seguenti fattori confondenti:

Assorbimento di batteri sulle superfici di particelle,

 Composti chimici come l'ammoniaca, lo zolfo elementare o solfuri, spesso presenti

 nei sedimenti, possono essere tossici anche per Vibrio fischeri;

Interferenza fisica sulla bioluminescenza da particelle non rimosse dalla filtrazione,

 Variazioni di Ph con diluizioni del campione.

 - Questo studio si concentra sul diluente (il mezzo) utilizzato per la risospensione e la

diluizione del campione, perchè influenza la salinità, il Ph, Eh e i processi che si

verificano durante il contatto del mezzo col sedimento.

Vibrio fischeri è un batterio plantonico che

vive anche sulla superficie delle particelle

.

in sospensione

SCOPO DELLO STUDIO:

Lo scopo dello studio è stato quello di verificare se i test eseguiti

con differenti diluenti hanno prodotto dati comparabili sulla

tossicità.

Gli effetti del mezzo su Vibrio fischeri sono stati studiati al fine di

dimostrare la sua capacità di influenzare l'emissione di luce su

questo organismo testato nel corso del tempo.

Materiali e metodi:

- batteri liofilizzati

- soluzione di ricostituzione

- cuvette

- filtri

- tubi per SPT

- analizzatore Microtox M500

Rispetto al protocollo per test di tossicità di Volpi Ghirardini e Pantani, scelto per il test,

si sono apportate alcune modifiche sui sedimenti e tempi di esposizione:

- il sedimento viene usato intero invece che centrifugato perchè la centrifugazione

non può rimuovere completamente l'acqua interstiziale e può anche provocare una

modificazione della composizione dei sedimenti: rappresenta una matrice

ecologicamente più rilevante.

- il tempo di esposizione è aumentato da 25 a 30 min, introducendo un ritardo di 5

min tra la fine della risospensione e la filtrazione, per migliorare la separazione tra

liquidi, batteri e particelle e migliorare la sensibilità del test

Test fase solida: Risospensione in 100 ml di

soluzione diluente e

agitazione a 100 rpm per 10 min e

10 gr di sedimento umido a 400 rpm per 3 min

Essicazione dei EC50

sottocampioni di 1,5 ml a sottocampioni

calcolata

105°C per 24h in capsula sulla base

di alluminio pre-tarato e del peso

corretto per contenuto di secco

sale DILUIZIONE SERIALE (1,5 ml, 5

REPLICHE) PER DETERMINARE IL

PESO SECCO DEI SEDIMENTI

> determinazione curva dose-risposta e valori EC50

tramite il software MicrotoxOmni version 1.18. Equilibrate per 10 min in

> Ph misurato in un'altra serie di diluizioni ottenute nello bagno termostatico a

stesso modo, all'inizio e dopo 30 min per valutare le 15°+0.2°C

variazioni Aggiunta di 20 μl di batteri

rivitalizzati in ogni replica

Si miscela con pipetta e si incuba per

20 min con agitazione e 5 min senza

500 μl della fase liquida dopo

filtrazione vengono trasferiti in cuvette

di vetro nel Microtox, lasciati Filtrazione, per separare i batteri

equilibrare per 5 min e poi viene letta dal sedimento

l'emissione di luce Non offre condizioni ottimali

Diluenti: per microrganismi e non

fa da tampone.

- soluzione standard per Microtox SPT, NaCl 35% Ha una bassa rilevanza

ecologica.

- due acque artificiali (ASWS): ASTM e EPA Due diluenti usati per test

di tossicità . Composizioni

molto simili tra loro tranne

che per la quantità di

- un'acqua di mare naturale: NSW alcuni sali e la salinità

finale.

- due soluzioni tampone fosfato Fornisce a Vibrio fischeri gli elementi necessari per il

mantenimento dell'omeostasi efficace e risposta

K2HPO4 e KH2PO4 in NaCl 20% disintossicante.

0,1 M (Pb.1) e 0,05 M (Pb.05) Diluente ottenuto campionando acque superficiali

rispettivamente nella Laguna di Venezia. Trasportato in lab entro 2

ore e filtrato a 0.45 μM.

Suddiviso in sottocampioni

e memorizzato in bottiglie di

politilene a -20°C al buio

fino all'analisi.

Campionamento dei sedimenti:

I campioni di sedimenti sono stati racconti da 4 siti della Laguna di Venezia, con

uno scavino. S. Giuliano (SG), zona subtidale

afflitta da inquinamento.

Granulometria argillosa-limosa,

46,5% contenuto acqua e 7,7%

materia organica

Darsena della Rana (DR) e Pili (PI),

zona industriale di Porto Marghera.

DR: terriccio. 48% cont acqua e

6,5% materia organica

PI: argilloso-limoso. 47% cont acqua

e 8,7% materia organica.

Rio de la Madoneta (RIO), canale

veneziano interno con sedimenti

I campioni sono stati setacciati (1 mm) fangosi.

per eliminare le frazioni più grossolane Cont acqua 48% e 10,3% materia

e congelati a -20°C fino al test. organica.

Test di emissione luminosa con sostanza tossica di riferimento e

diluente:

Il tossico di riferimento ZnSO4* 7H20 (solfato di zinco) è stato utilizzato per testare la

qualità della partita di Vibrio fischeri secondo la procedura BasicTest in due repliche.

-Il test si esegue utilizzando il diluente standard per campioni liquidi (NaCl 20%).

-Poi si esegue in confronto a questo, un test di confronto utilizzando:

NSW- congelato -------> il congelamento mantiene la qualità dell'acqua costante fino al test

 NSW- fresco

 -Poi si esegue una prova di confronto degli effetti dei diversi diluenti sulla bioluminescenza:

1. Si prepara il tossico di riferimento sciogliendo solfato di zinco in NSW-fresco e NSW-

congelato, per verificare l'effetto del congelamento sulla risposta batterica.

2. si aggiungono 10 μl di batteri per ciascuna cuvetta contenente 1 ml di diluente

considerato

3. si legge l'emissione luminosa ogni 5 min per 30 min con Microtox M500 .

4. Il Ph delle cuvette si misura all'inizio e alla fine del test per misurare le variazioni.

Risultati:

Test di riferimento di sostanze tossiche

Valore dell'EC50 ottenuto con il diluente standard (NaCl 20%) per il test del tossico

 di riferimento è 3.71 mg/l ZnSO4

Il range di confidenza è 3.50-3.94 quindi il valore ottenuto è compreso in quelli

previsti dal certificato di esecuzione del specifico lotto di batteri.

I dati ottenuti con NSW-congelato (6.61 mg/l ZnSO4; 95% intervallo di confidenza:

 5.61-7.78)

NSW-fre (7.80 mg/l ZnSO4, 95% intervallo di confidenza:7.45-8.17)

sono simili e superiori a NaCl 20% probabilmente per la presenza di sostanze

complessanti.

Test d'emissione della luce: Il congelamento non modifica la capacità

 di NSW a mantenere la bioluminescenza.

I dati sono simili per NSW-congelato e

fresco.

EPA, ASTM e NSW mostrano andamenti

 simili. La riduzione dell'intensità della luce

è tempo dipendente.

L'andamento dell'emissione in Pb.1

 differisce da EPA, ASTM e NSW nei primi

min poi si allinea.

L'emissione in Pb.05 è inferiore rispetto a

 tutti gli altri diluenti ma non varia nel

tempo.

L'emissione in NaCl 35 è inizialmente

 inferiore a EPA e ASTM ma arriva ad

esser simile dopo 10 min (tempo

dipendente).

Intensità Relativa di Bioluminescenza (RBU) in

funzione del tempo di esposizione della

sospensione batterica in differenti diluenti Ph finale di NaCl35 più

alcalino.

Conferma che non è il mezzo

per il test di tossicità Microtox

ottimale perchè la sua

capacità buffer non neutralizza

gli effetti dell'attività batterica.

Variazioni basse

in soluzioni Pb e

acque marine

Il test di confronto dimostra che la capacità dei vari diluenti di mantenere la

bioluminescenza di Vibrio fischeri è diversa:

- tendenze simili per ASTM, EPA e NSW

- riduzione dell'intensità della luce tempo dipendente

- il congelamento di NSW mantiene l'emissione della luce allo stesso livello

dell'NSW fresco e danno entrambi risposte simili.

Test fase solida:

I valori di EC50 calcolati

dai test con buffer

fosfato sono inferiori a

quelli in acque di mare

o NaCl35.

Pb.1 e Pb.05 sono

simili tra loro

- Valori ottenuti coi test in Basse variazioni Ph per

ASTM, EPA e NSW sono le soluzioni Pb.

simili ma paragonabili. Le variazioni maggiori

- Test in EPA hanno sono in NaCl35, per cui i

maggiore tossicità livelli superano i range

rispetto a test in NSW. raccomandati per SPT.

La rilevanza statistica delle differenze nei test con diversi diluenti, poi, è stata

controllata utilizzando campioni appaiati t-test a diversi livelli di significatività.

I risultati dimostrano che la tossicità è legata al diluente selezionato.

Nonostante il numero di campioni limitato di sedimenti testati, l'elaborazione statistica

indica che i risultati utilizzando le soluzioni tampone fosfato sono comparabili (R=0.98),

ma differiscono da quelli ottenuti usando acqua artificiale (EPA e ASTM) e NSW, che

sono simili tra loro.

Le soluzioni in Pb aumentano la sensibilità del test rispetto a quella in EPA, ASTM, NSW

o NaCl35.

Discussioni:

L'analisi del grado di correlazione tra i test con diversi mezzi sottolinea l'esistenza di alcuni

meccanismi che causano le differenze osservate (es. alta correlazione tra le PB tra loro e

rispetto agli altri mezzi fa pensare ad un'azione da parte degli ioni fosfato).

L'assorbimento di sostanze tossiche e batteri alle particelle di sedimenti in sospensione

dipende da molti fattori: la natura della sostanza tossica, i ceppi batterici, la composizione

dei sedimenti, la morfologia, ma anche la chimica e le caratteristiche fisiche del mezzo di

risospensione.

A cosa sono dovute le differenze di tossicità riscontrate nei diversi sedimenti?

Ph

L'adesione batterica alle superfici è determinata da parametri quali le interazioni

 idrofobiche, forze di Van der Walls e interazioni elettrostatiche.

Il Ph, dunque è un fattore di controllo molto importante perché la carica ionica e quindi la

forza elettrostatica è spesso Ph dipendente.

I nostri dati infatti mostrano che le soluzioni tampone fosfato hanno un Ph subacido(6,7-

6,8) e i valori EC50 sono inferiori a quelli delle acque marine e del NaCl35.

Inoltre, molti composti organici mostrano una tossicità Ph dipendente, come