Ecotossicologia - NP Poecilia reticulata

MA

il NP può avere effetti dannosi su importanti processi fisiologici senza coinvolgimento

dei recettori degli estrogeni.

Ad esempio, l'acetilcolinesterasi (AchE) nel ratto nelle cellule PC12 incubate con NP

per 24h è risultato essere inibita significatamente e l'aumento di acetilcolina causa una

diminuzione dei recettori colinergici.

Il guppy è da tempo utilizzato come modello animale popolare in ricerca ecologica ed

 evolutiva nonché in studi comportamentali, ma recentemente è applicato anche come

organismo in esami sia in situ sia in laboratorio, per studi d'inquinamento ambientale

perchè è prontamente disponibile e facilmente gestito per le piccole dimensioni del

corpo e per il breve ciclo di vita.

Le ChEs sono una classe si idrolasi generalmente classificate in due

 classi di enzimi:

- AchE, acetilcolinesterasi

- BchE, butirrilcolinesterasi

Molte pubblicazioni hanno riportato che la forma principale di ChE nel

muscolo dei guppy è la AchE, e che questa ha un elevato livello di

attività.

Questo suggerisce che la AchE nei guppy è un biomarker sensibile

alle sostanze inquinanti.

Scopo dello studio:

L'obiettivo di questo studio è esaminare gli effetti

dell'esposizione a breve termine a NP sull'attività della ChE e

della carbossilesterasi (CbE) di guppy maschi.

Alcuni inquinanti ambientali che inibiscono l'attività della ChE

possono inibire anche la CbE.

Dunque, sono state misurate le attività della ChE nel muscolo,

nella testa e della CbE nel fegato di guppies maschi esposti a

10, 60, 150, o 300 mgL-1 di NP per 1, 2, 4, o 7 giorni di

trattamento.

Materiali e metodi:

Reagenti e animali:

- Il NP (94%)

- Il 3-aminobenzoico di etile (MS222)

- L'acetone (HPLC)

La soluzione stock di prova viene preparata sciogliendo NP in acetone.

- Maschi adulti di guppy, acclimatati in laboratorio ad una temp di

28+2°C per 12h e per almeno 7 giorni prima dell'esperimento.

I guppy sono stati alimentati ogni giorno con scaglie di cibo asciutto.

Per non creare lisciviati, potenziali interferenti endocrini, non sono

state usate materie plastiche nell'acquario e nell'impianto idraulico.

É stata utilizzata acqua senza cloro.

Disegno dello studio:

I pesci sono stati esposti sia a NP a concentrazioni nominali di 10, 60, 150, o 300

mgL-1, sia di solo acetone ad una concentrazione nominale di 30 mgL-1 come

solvente controllo per diversi periodi di esposizione (1, 2, 4, o 7 giorni).

Ogni gruppo di 5 guppy maschi è stato mantenuto in 5 lt di acqua in un bicchiere di

vetro e alimentato 3-4 mg 30 minuti prima della sostituzione della soluzione stock di

prova. Questo avviene ogni 24h per mantenere le condizioni di trattamento.

I pesci morti vengono rimossi per tutto il periodo sperimentale.

Il trattamento di 4 giorni è stato ripetuto 2 o più volte a concentrazioni di NP nominali

di 150, 300 o 900 mgL-1, di con solo acetone alla concentrazione nominale di 30 mgL-

1, come controllo per verificare ulteriormente gli effetti del NP sull'attività della ChE nel

muscolo dei guppy e la tossicità acuta del NP per guppy maschi.

Tutti i guppy esposti a 900 mgL-1 sono morti e l'attività della ChE del muscolo e della

testa e della CbE del fegato è stata misurata solo nei pesci esposti a 150 e 300 mgL-1

di NP.

Dopo 1, 2, 4, o 7 giorni di trattamento, tutti i pesci sono stati anestetizzati in MS222 (3-

aminobenzoico di etile).

Sono stati poi tagliati e pesati i campioni di fegato, testicolo, e muscolo, e calcolati gli

indici gonadosomatico (GSI) e epatosomatico (HSI) per ogni guppy.

I campioni di muscolo, testa (ChE) e fegato (CbE) sono stati conservati a -80°C fino al

saggio.

Misurazioni dell'attività della ChE:

I campioni di testa e muscolo Gli omogenizzati vengono

vengono omogenizzati 1:10 centrifugati a 12,000 g per 20

con 1M EDTA e 0.5% Triton X- min a 4°C

100 in soluzione tampone

fosfato 0.1 M (Ph 7.5)

- Il tasso di incremento della densità ottica del MISURAZIONE DELL'ATTIVITà

mezzo di reazione è stato misurato con uno

spettrofotometro a 412 nm per 60 sec a temperatura DELLA ChE TRAMITE TECNICA

ambiente. COLORIMETRICA DI ELLMAN

- A causa dei limitati volumi di campione muscolare,

l'attività della ChE è stata misurata 2 volte.

- L'attività enzimatica è espressa (come unità di

misura) in mol di proteine.

La reazione viene innescata aggiungendo 10 μl di substrato (acetilcolina

ioduro per campioni di testa e muscoli e butirrilcolina ioduro per campioni

di muscolo) 75 mM

a 990 μl di una miscela contenente:

50 μl di dithiobisnitrobenzoato 0,01M e

50 μg di proteine di muscoli e testa (nell'acetilcolina ioduro)

o

200 μg di proteine di solo muscolo (nella butirricolina ioduro),

in un buffer tampone fosfato 0,1M Ph 8.0

Misurazione dell'attività della CbE:

I campioni di fegato vengono Gli omogenizzati vengono

omogenizzati 1:10 con 0.2mM centrifugati a 12,000 g per 20

EDTA in soluzione tampone min a 4°C

Tris-HCl 0.05M (Ph 8,0) IL SUPERNATANTE è STATO

- Il tasso di incremento della densità ottica del UTILIZZATO PER LA

mezzo di reazione è stato misurato utilizzando uno MISURAZIONE DELL'ATTIVITà

spettrofotometro a 405 nm per 60 sec a DELLA CbE, CON ACETATO DI P-

temperatura ambiente.

- Le attività della CbE sono state misurate 2 volte. NITROFENILE COME SUBSTRATO

- L'attività enzimatica è espressa (come unità di SECONDO IL METODO DI

misura) in mol di proteine. LJUNGQUIST E AUGUSTINSSON.

La reazione viene innescata aggiungendo 10 μl di p-nitrofenil (in

etanolo) 0,05M

a 1 μl di una miscela contenente:

50 μg di proteine epatiche

in un buffer tampone Tris-HCl 0,05 M Ph 8.0

Le concentrazioni di proteine dei campioni di testa, muscolo o fegato sono

stati misurati con il metodo Bradford, con albumina di siero bovino come

standard. Le misurazioni sono state effettuate 3 volte.

La tossicità acuta del NP per guppy maschi è stata determinata dalla

mortalità giornaliera riscontrabile dai diversi esperimenti di trattamento

con concentrazioni comprese tra 10-900 mgL-1.

Le concentrazioni nominali letali per il 50% degli organismi (LC50) per NP a

96h sono stati calcolati utilizzando il Programma d'analisi di SpearmanKarber.

Nessun test statistico è stato condotto a causa delle limitate dimensioni del

campione.

Le differenze tra i gruppi di trattamento sono stati analizzati con il test di

Kruskal-Wallis, un test non parametrico, utilizzando il programma Minitab.

Se veniva trovato un risultato significativo, veniva usato il test di Mann-

Whitney per determinare quali gruppi di trattamento erano significativamente

differenti dai controlli. Le differenze sono state considerate significative se

P<0.05.

Risultati:

Effetti di NP sull'attività della ChE e della CbE nei diversi tempi di trattamento

L'inibizione dell'AChE nel muscolo è

diminuita di circa il 30-40% in tutti i gruppi

di trattamento dopo l'esposizione di 4

giorni e nei gruppi NP-trattati con 60 e

150 mgL-1 dopo esposizione di 7 giorni.

No variazioni evidenti per la BchE.

É stata osservata una grande

variazione ma nessuna chiara

tendenza nell'attività della ChE nella

testa di guppy maschi nei diversi

gruppi NP-trattati provenienti da

diverse esposizioni di tempo. No differenze nell'attività della CbE nel fegato

di guppy maschi tra i diversi gruppi NP-trattati

dopo 1, 2, o 4 giorni di trattamento.

Invece, un incremento del 40% è stato trovato

su gruppi trattati con 10, 60, e 150 mgL-1 di

NP dopo esposizione di 7 giorni.

Effetti dell'NP su guppy maschi dopo 4 giorni di esposizione

Tra i 3 esperimenti di trattamento di 4 giorni indipendenti, un pesce è morto col

trattamento di 300 mgL-1 di NP, mentre non ci sono stati a cambiamenti significativi nei

valori di GSI e HSI dei pesci esposti a 150 e 300 mgL-1 rispetto al controllo.

C'è stata un'inibizione dell'attività della

ChE muscolare (73% e 65% rispetto ai

loro controlli) statisticamente significativa

dopo l'esposizione di 4 giorni a 150 o 300

mgL-1.

No differenze di attività per la ChE della testa e la CbE del fegato di guppy maschi esposti a

150 o 300 mgL-1 rispetto al controllo.

Sulla base dei dati il valore di LC50 è stato stimato essere 475 mgL-1 con il 95% di intervallo di confidenza del

401-563 mgL-1.

Discussioni:

In questo studio non sono stati trovati cambiamenti significativi nella GSI e nella

HSI di guppy maschi dopo 4 giorni di trattamento con NP, ciò può essere dovuto

all'esposizione a breve termine del tossico.

L'inibizione della ChE può esser utilizzata come biomarker per l'esposizione ai pesticidi

OP e pesticidi carbammati in vivo.

In questo studio, le concentrazioni di NP che causano l'inibizione nei pesci, sono nella fascia

alta del range di concentrazione che si verificano nell'ambiente acquatico. Queste informazioni

possono implicare trascurabili effetti colinergici acuti sugli animali esposti a NP nell'ambiente

acquatico.

Bisognerebbe approfondire gli studi per esaminare l'esposizione di NP sull'inibizione della ChE

in animali acquatici diversi

INFATTI

ci sono prove contrastanti riguardo la reattività dei diversi tessuti all'inibizione della ChE in

animali acquatici.

É stato osservato inoltre, che l'inibizione della ChE nel muscolo è un migliore predittore

di mortalità acuta rispetto all'inibizione della ChE nel cervello.

In questo studio infatti, l'inibizione della ChE nel muscolo (fino al 65% del controllo) era molto

inferiore che nella testa (fino al 87% del controllo), in guppy maschi esposti a 300 mgL-1 di NP

dopo 4 giorni di trattamento con un valore di LC50 di 475 mgL-1. E inoltre, una diminuzione

significativa dell'inibizione della ChE è stata osservata solo nel muscolo e non nella testa, in

guppy maschi esposti a 150 o 300 mgL-1.