Ecotossicologia

SHAKE-FLASK

Parti uguali di acqua e n-ottanolo in un imbuto separatore + una concentrazione NOTA della sostanza da analizzare. Si agita, + agitate meglio è (almeno 30 minuti), per mettere in contatto tutte le molecole della sostanza sia con acqua che ottanolo. Le molecole della mia sostanza si distribuiranno maggiormente in acqua o ottanolo in base alla sua affinità. Acqua è più pesante quindi si separa da ottanolo che rimane in superficie. Imbuto ha tappo in alto e rubinetto in basso. Dopo avere lasciato separare i due fluidi si fa uscire dal rubinetto l'acqua e la si rinserisce più volte nell'imbuto. Quando n ottanolo si avvicina al rubinetto devo rallentare il flusso, è poi preferibile lasciare un po' di acqua nell'imbuto piuttosto che perdere ottanolo nell'ultimo passaggio. Si potrà eliminare l'acqua in + con il solfato di sodio anidro. Raccolgo il mio n-ottanolo e attraverso analisi gas-cromatografica valuto la C della mia

sosttanza all interno del nottanolo. Sottraendo alla mia concentrazione di sostanza iniziale, la concentrazione di sostanza ottenuta sperimentalmente Cott, ottengo la concentrazione nell'acqua. Ciniz. - Cott. = C H2O Problemi del metodo shake-flask: 1. tempi di esecuzione piuttosto lunghi 2. grosse quantità di composto puro sono necessarie Perché spesso sono molecole sconosciute appena prodotte e se ne produce poca inizialmente. 3. formazione di emulsioni tra le 2 fasi quando agito, se elimino perdo campione, se le tengo sottostimo kow. Per eliminare queste emulsioni posso: - aggiungere Sali, ma è sconsigliabile perché aggiungo un'altra sostanza. - usare del ghiaccio per raffreddare il mio contenitore e eliminare le bollicine di emulsione, oppure: SLOW STIRRING METHOD Bassa agitazione per un tempo + lungo (una notte) fatta con un ancoretta e agitatore magnetico, solo dopo metto in imbuto separatore e così evito miscelazione METODO HPLC- High performance

Il cuore dello strumento HPLC è una colonna con all'interno un rivestimento con tanti composti diversi. A noi interessa una colonna con fase stazionaria costituita da molecole di 18 atomi di carbonio C18, sono catene idrocarburiche, quindi colonna con molecola apolare e lipofila. A valle della colonna c'è un detector che misura quando passa una molecola, un'altra parte del HPLC è sito di iniezione della sostanza che finisce in un loop insieme a una soluzione all'interno dello strumento fino ad arrivare alla colonna. La spinta è data dalla alta pressione generata da pompe. La mia soluzione è composta da acqua e metanolo (soluzione polare) + la mia molecola e spinta dalle pompe (fase mobile). Se la mia sostanza è una molecola lipofila preferirà stare nella fase stazionaria con molecole apolari e si lega a catena C18, ma spinta dalle pompe torna alla fase mobile. La molecola effettuerà più giri.

prima di uscire dalla colonna. Tempo di uscita della molecola è detto tempo di ritenzione. Se molecola idrofila, riuscirà a passare velocemente perché non lega con C18 e uscirà presto dalla colonna→ il detector leggerà prima il passaggio di molecole idrofile. Dopo 5 esce idrofila dopo 10 minuti lipofila.

Come calcolo kow? Il tempo di ritenzione della molecola ignota viene confrontato con quelli ottenuti con sostanze di cui si conosce già il Kow, faccio una proporzione. La proporzione avviene tra sostanze che hanno un tempo di ritenzione simile tempo di ritenzione mol. Ignota: tempo rit molecola nota = kow x: kow noto➔ risolvo proporzione e trovo kow

Il metodo non serve con sostanze molto lipofile (log Kow>5) o molto idrofile (log Kow<1)=applicazione limitata

LEZIONE 15

QSAR-Quantitative Structure Activity Relationship

Valutano la relazione esistente tra la struttura chimica di una molecola e la sua attività biologica.

Molecole simili

hanno tossicità simili. Si utilizza per ipotizzare il kow di una molecola sconosciuta. Calcolo kowsperimentalmente con i 3 metodi visti precedentemente. Il QSAR è un metodo teorico che uso come prova del nove,se trovo kow che si assomigliano allora la parte sperimentale vera e propria ha funzionato bene.→struttura chimica della mia molecola→ ricerco nelle banche dati esistenti esistenza di similitudini fra le strutturechimiche della mia molecola e di altre→caratteristiche tossicologiche di queste molecole simili

Se la molecola di cui voglio scoprire il kow ha una struttura chimica simile a quella di altre posso ipotizzarne il Kow

Coefficiente di ripartizione (carbonio organico) Corg. /acqua (KOC)

E’ utile per valutare la distribuzione tra i sedimenti,suolo (o il materiale particolato sospeso) e l’acqua.

Koc= Kp/Foc

Kp è un rapporto fra la concentrazione di una sostanzain un solido (suolo/sedimento) e la concentrazionedella sostanza in acqua

di Foc. La relazione è la seguente: log(Koc) = a * log(Foc) + b dove a e b sono costanti determinate sperimentalmente. Questo metodo permette di stimare il coefficiente di ripartizione Koc a partire dalla frazione di carbonio organico Foc. In generale, un valore più elevato di Foc indica una maggiore capacità di legame delle sostanze lipofile al carbonio presente nel suolo, nei sedimenti o nel materiale particolato sospeso. Tuttavia, è importante considerare che il rapporto tra Foc e Koc non è diretto, ma dipende anche da altri fattori. Ad esempio, se si considera il DDT, una sostanza lipofila, un elevato rapporto Csol/Cacqua indica una maggiore affinità del DDT per il carbonio presente nel suolo o nei sedimenti. Tuttavia, la concentrazione di Foc influisce anche sul valore di Koc: se Foc è elevato, il valore di Koc sarà basso, mentre se Foc è basso, il valore di Koc sarà alto. In conclusione, il metodo indiretto per la valutazione del coefficiente di ripartizione Koc permette di stimare questo parametro a partire dalla frazione di carbonio organico Foc, utilizzando una relazione lineare tra log(Koc) e log(Foc).di kow. È una relazione sperimentale. Ne individuò anche un'equazione. La retta interseca x in un punto corrispondente a -0,21 sull'asse y se la retta proseguisse. Quindi se conosco kow di una sostanza, spesso è segnalato sulle etichette di queste sostanze, è un parametro noto, applicandol'equazione trovo koc. Coefficiente di ripartizione acqua/aria KAW è un rapporto fra la solubilità di una sostanza in acqua e la solubilità della stessa sostanza in aria. (solubilità=concentrazione; sono espresse sempre in moli/m3 = quantità/volume) →P Equazione dei gas perfetti PV = nRT Pressione * volume del gas = numero di moli * costante R * temperatura →n Se la riarrangio /v corrisponde a solubilità in aria P/Sw è la costante della legge di Henry (Kh) Legge di Henry: la solubilità di un gas è direttamente proporzionale alla pressione che il gas esercita sulla soluzione (a temperatura costante) →P = khC k = P/C P è lapressione che il gas esercita sullasoluzione ed è uguale alla costante di Harry(specifica per ogni gas) * C che è laconcentrazione nell'acqua della miasoluzione.costante di Harry è quindi uguale aP/C.Una volta la volatilità era considerata solo intermini di tensione di vapore, KAW è moltopiù precisa, essendo adimensionale. Peralcune molecole la tensione di vapore non eramolto corretto DDT aveva tensione di vapore600 volte inferiore a benzene; in realtà conKAW si vede che DDT ha una volatilità solo 200volte inferiore rispetto a KAW del benzene. Se abbiamo molecole con bassa solubilità in acqua (sostanza lipofile) che è al denominatore nel rapporto, la molecola avrà un elevata KAW. Anche se non ha elevata tensione di vapore,secondo la vecchia definizione, in realtà ha volatilità superiore a patto che sia lipofila e quindi sia poco solubile inacqua.KOC, KOW, KAW servono per stimare dovefinirà una molecola, in quale comparto ambientale devo investire nella mia ricerca? La tabella mostra l'affinità in base al coefficiente di ripartizione con comparti come aria, suolo e biomassa (con i lipidi negli organismi). ES: una sostanza con log kow >5 avrà affinità con i lipidi. Log kow <1 è idrofila e non si accumula negli organismi. ASSORBIMENTO, DISTRIBUZIONE E METABOLISMO DI UN CONTAMINANTE. Xenobiotica è una qualsiasi sostanza che non viene prodotta da un organismo ma entra al suo interno. Da dove entrano? Polmoni, intestino, cute. Per poi finire nel sangue e negli organi e in parte poi eliminate. PROCESSI DI ASSORBIMENTO CELLULARE Per esplicare la sua azione tossica, un contaminante deve innanzitutto passare la membrana plasmatica e raggiungere una certa concentrazione: - TRASPORTO PASSIVO: avviene a favore di un gradiente di concentrazione e non viene usata ATP - TRASPORTO ATTIVO - ENDOCITOSI La diffusione semplice viene fatta da molecole polari cheLe molecole idrofile entrano per filtrazione, utilizzando un gradiente idrostatico, cioè sfruttando la pressione, e entrano attraverso canali. Che differenza c'è tra canali e carrier? I canali sono rivestiti di acqua e per questo consentono il passaggio di molecole idrofile. Possono entrare o uscire dalla cellula. I carrier, invece, per il trasporto passivo non sfruttano energia metabolica. La molecola viene riconosciuta, il carrier la lega, cambia conformazione e la rilascia all'interno del citoplasma, senza utilizzare ATP.carrier sono specifici ma possono essere ingannati da piccole molecole di ©. Trasporto attivo→ Richiede un sistema di trasporto (carrier) ed energia metabolica per trasportare grosse molecole polari e gli xenobiotici apolari contro gradiente di concentrazione. Anche in questo caso © possono ingannare la specificità dei carrier. Esempio: pompa sodio-potassio: costituito tra proteina transmembrana e enzima Na-K ATPasi che richiede presenza di fosfolipidi.→Tre ioni sodio si legano alla proteina recettore, il legame tra ioni e proteina causa fosforilazione della proteina grazie a ATP che diventa ADP, la produzione di energia serve a cambiare la conformazione della proteina che accoglie 2 ioni potassio rilasciando i tre ioni sodio fuori dal citoplasma. Il legame tra gli ioni potassio e la proteina transmembrana, determina la defosforilazione, il fosforo è allontanato e la