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Ruolo dei microRNA nella plasticità sinaptica

Appunti di Neurobiologia molecolare sul Ruolo dei microRNA nella plasticità sinaptica basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Presutti dell’università degli Studi La Sapienza - Uniroma1, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Neurobiologia molecolare docente Prof. C. Presutti

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In questo lavoro sono stati fatti esperimenti di ibridazione in situ,

immunocitochimica, e si è visto che queste strutture granulari Rientrano nella

famiglia dei P-body perché contengono proteine dei P-body classiche,

microRNA, Ago2 quindi una proteina fondamentale del RISC, hanno anche una

dentritic P-body like

dinamica perché si è visto che questi P-body neuronali “

structures” (dlP-bodies) avanzano lungo il dendrite e non solo, la loro

composizione cambia per cui quando giungono ai terminali, quindi alle spine

dendritiche, è come se ci fosse una liberazione di Ago2. Questo si pensa essere

associato all'attivazione del messaggero e cioè vengono meno i fattori

repressori, in questo caso del RISC, e vedremo come quest'osservazione è

validata da altri esperimenti. Esistono queste strutture nei neuroni e nelle

terminazioni dendritiche sono stati identificati i microRNA. Le tecniche che

hanno permesso l' individuazione e quindi il clonaggio, e l'identificazione dei

microRNA alle sinapsi, sono varie. L'approccio del clonaggio e sequenziamento

è quello più valido che non presuppone delle ipotesi di partenza, e questa

tecnica si sta sviluppando tantissimo grazie a queste nuove procedure di

sequenziamento su larga scala. Quindi si cerca di isolare sempre di più RNA

localizzati in regioni specifiche di clonarli e di sequenziarli. Questo è stato il

primo approccio e sequenziamento dei miR presenti nei sinaptosomi. Per dire

che veramente facevano parte della regioni post-sinaptiche si è utilizzato un

approccio biochimico quindi l'isolamento dei sinaptosomi (che sono quegli

artefatti biochimici che comunque contengono quei fattori post-sinaptici,

vescicole sinaptiche e microRNA). Una volta identificati i microRNA a livello

sinaptico gli studi successivi sono stati fatti per vedere quali erano solamente

nei processi dendritici e nelle spine e quali erano solo presenti nel corpo

cellulare. Questo è stato fatto con la tecnica del Laser Capture e RT-PCR, in cui

si utilizza un microscopio e quindi dall'osservazione al microscopio di una

coltura primaria di neuroni ippocampali si individua la regione che corrisponde

al corpo cellulare piuttosto che la regione che corrisponde al processo

dendritico e attraverso una procedura in cui vengono catturate regioni definite

nella cellula, e quindi si ha estrazione di macromolecole presenti nella cellula, è

estratto l'RNA e esaminato per RT-PCR. Si è visto in questo lavoro che ci sono

certi microRNA che stanno solo nei dendriti e questo è molto importante perché

vuol dire che il loro target evidentemente stanno al livello dei dendriti e sono

quelli che dobbiamo guardare con maggiore attenzione se vogliamo studiare

quei processi di plasticità legati ai microRNA e di sintesi proteica. Quindi in

questo caso dobbiamo fare un'ipotesi, pensiamo che nei dendriti ci siano miR

neuronali quindi lavoriamo ad esempio con una serie di probe per RT-PCR di

miR neuronali e troviamo quali di questi probe mi danno un segnale positivo

per l' RNA che è stato isolato dai dendriti piuttosto che dal soma. Se vogliamo

visualizzare la localizzazione del miR: l'uso dei miR hanno portato all'utilizzo di

tecniche nuove perché c'erano dei problemi sperimentali di analisi legati alla

loro piccola dimensione e lavorare con esperimenti di ibridazione crea un

problema di una bassa temperatura di ibridazione, perché già a basse

temperature un piccolo frammento tenderà già a staccarsi dal suo

messaggero,quindi sono state elaborate delle tecniche che permettono di

rafforzare il legame tra il piccolo RNA e il suo target. Quindi sono stati creati

degli RNA modificati, nel caso specifico si tratta di oligonucleotidi a LNA in cui

aumenta l'avidità del legame tra il microRNA e la sua sequenza target.(Quindi

anzichè usare oligo-antisenso come si fa negli esperimenti che utilizzano

sonde, si usano gli oligo ad LNA che sono complementari ai miR, li vedono e gli

si attaccano in maniera avida). La denaturazione avviene quindi a temperature

molto più alte, quindi è più facile lavorare con maggiore tranquillità ed

eliminare il background che rovinerebbe il segnale ecc. Quindi l'ibridazione in

situ viene fatta con sonde a LNA (che sono utilizzati anche per l'ibridazione in

situ, per i northern blot e i microarray).

Quello che sappiamo è che la trascrizione dei microRNA viene attivata

dall'attivazione sinaptica, è questo avviene a diversi livelli come la regolazione

trascrizionale vedremo che i miR più noti a livello di plasticità hanno delle loro

sequenze regolatrici che contengono delle sequenze segnale per fattori di

trascrizione di cui vedremo si sa essere attivati da processi di plasticità

sinaptica questo è il caso di CREB e MEF2 ecc. In presenza di plasticità

sinaptica si ha l'attivazione della cascata di segnale che porta quindi alle

protein-chinasi, quindi la fosforilazione del fattore di trascrizioni e quindi un

aumento dell'interazione con le sue sequenze regolatrici sul promotore del

gene dei microRNA. Però ci sono altri processi attraverso cui l'attivazione

sinaptica induce l'espressione dei miR e questi riguardano il trasporto che si

pensa seguano lo steso meccanismo che abbiamo descritto per i messaggeri, e

probabilmente il microRNA viene trasportato lungo i dendriti proprio perché già

nel citoplasma complessa il suo target e quindi già lo segue in questo processo

che abbiamo descritto per il messaggero. Quello che si è visto è che il pre-miR

è presente nelle terminazioni sinaptiche e l'attivazione sinaptica attiva il

processamento da parte di Dicer. Si pensa che ci sia un altro giocatore, una

proteina che interferisce con l'attività di DICER e media il taglio

endonucleolitico atto a rimuovere la regione del loop. Un ultimo meccanismo

che si sta definendo sempre di più è la inattivazione di RISC, ossia il il mi-RISC è

depositato sul messaggero, in presenza di attivazione sinaptica quindi ingresso

del calcio, o attivazione delle chinasi calcio-calmodulina dipendenti (CaMKII), si

ha la modificazione di uno dei fattori regolatori, in questo caso di MOV10 e

Armitage, e quindi la liberazione del messaggero che può essere a questo

punto tradotto (MOV10 viene rimosso). In questa conformazione RISC non è più

attivo. Quindi ricordiamo che affinché RISC sia attivo nell'inibire la traduzione di

questo messaggero, deve contenere vari elementi tra cui MOV10 e Armitage, e

nel momento in cui uno di questi elementi viene rimosso ad esempio per

allentamento della sua interazione con gli altri elementi di RISC (Qui è riportata

la fosforilazione delle proteine Ago e RBP),RISC non è più nella sua

conformazione attiva e funzionale e quindi la sintesi proteica parte.

Abbiamo detto che così come CREB è coinvolto in un enorme numero di

processi di attivazione trascrizionale neuronale e si è visto essere proprio CREB

uno degli effettori della plasticità sinaptica, il suo ruolo è descritto anche per

l'induzione dei microRNA coinvolti nell'interazione sinaptica perché ci sono

diversi studi che dimostrano che le sequenze regolatrici di alcuni microRNA

neuronali neurospecifici contengono sequenze di legame di CREB E MEF2 e di

altri fattori trascrizionali neuronali specifici.

Adesso entriamo un po' più nel dettaglio sperimentale per quanto riguarda

l'osservazione che il complesso RISC è presente alle sinapsi ed è un effettore

dell'attività sinaptica e vedremo esperimenti che corroborano l'affermazione

che il microRNA sono i mediatori della plasticità.

Questo esperimento riguarda Drosophila e circuiti neuronali di Drosophila e

quindi ha tutta una sua terminologia che è legata alla genetica di Drosophila. È

molto importante perché è il primo lavoro che dimostra che il RISC è un

effettore della plasticità sinaptica e risponde all'attivazione sinaptica attraverso

un meccanismo. Drosophila ha un sistema nervoso molto semplice, ed è

particolarmente idoneo a esperimenti di neurofisiologia e biochimica in quanto

contiene circuiti composti da neuroni olfattivi che percepiscono il segnale

olfattivo che arriva attraverso le antenne, dove sono presenti i neuroni

sensoriali,che trasmettono al livello di queste strutture (lobi olfattivi).

I neuroni olfattivi poi proiettano s strutture superiori e l'informazione che è utile

a noi è che il neurone olfattivo proietta verso la struttura che è la Calix (nella

calix ci sono gli assoni) e percepisce l'informazione a livello dei lobi delle

antenne ,ediante il suo albero dendritico. A differenza degli organismi superiori

si è visto che la chinasi calcio-Calmodulina dipendente CaMKII (che è altamente

conservata) è presente sia negli assoni che nei dendriti. Questa chinasi si

sapeva già essere coinvolta nei meccanismi di plasticità sinaptica, che in

seguito all'attivazione sinaptica e in seguito a fenomeni di plasticità come

quello usato in questo esperimento (plasticità legata alla percezione di un

odore e all'associazione dell'odore a uno shock elettrico), la chinasi CaMKII

viene indotta, quindi la sua sintesi aumenta e tutti processi a valle rispetto a

CaMKII.

Quest'esperimento ve l ho riportato perché viene prodotto un costrutto

chimera, che porta anche la sequenza codificante di CaMKII, fusa alla GFP,

(quindi questo è un costrutto reporter che mi permette di localizzare CaMKII),

abbiamo poi un costrutto controllo che contiene soltanto il GFP.

Il costrutto chimera contiene quindi la proteina chimera e la 3' UTR di CaMKII.

Quello che è stato visto è che la 3'-UTR di CaMKII è indispensabile per la

localizzazione di CaMKII sia pre-sinapticamente che post-sintapticamente.

Infatti là dove manca la 3'-UTR di CaMKII, CaMKII viene a localizzarsi solo nelle

regioni pre-sinaptiche. Quindi solo nella 3'-UTR ci sono delle sequenze

riconosciute da RBP, ma queste RBP sono presenti solo negli assoni perché non

sono necessarie per la localizzazione dendritica. Una prima osservazione è che

CaMKII ha una localizzazione sia pre-che post-sinaptica e nella sua 3'-UTR ci

sono i segnali necessari per la sua localizzazione post-Sinaptica.

(Praticamente CaMKII deve essere presente sia pre che post-

sinapticamente però per trasportarla post sinapticamente, quindi nei

dendriti,è necessario che CaMKII venga riconosciuta da RBP che

legano la sua 3'-UTR e l'esperimento seguente che lo dice)

In questo esperimento vengono utilizzati due costrutti, uno che porta la 3'-UTR

di CaMKII e uno che non ha niente. Questo costrutto viene espresso solamente

nelle regioni presinaptiche degli assoni. Perchè ci sia espressione di CaMKII nei

dendriti post-sinapticamente, è necessario che ci sia una 3' UTR. Questa è

un'osservazione che prescinde dal discorso di RISC però riprendere

l'esperimento di Kandel che abbiamo visto nella lezione precedente. Che cosa è

stato osservato? Che RISC regola l'espressione di CAMKII. In un sistema come

quello della Drosophila creare dei Knock-out, se non sono letali è una cosa

molto rapida, quello che si è visto è che mutanti sia per Dicer che non

maturano i miR, che per armitage, uno dei fattori del RISC,producono più

CaMKII, quindi questa osservazione fa pensare che RISC regoli negativamente

CaMKII. Se con c'è RISC CaMKII è espressa maggiormente. Questo sistema di

Drosophila passa attraverso il sistema colinergico per cui viene attivato dalla

staufen,uno

nicotina e quello che è stato visto è che dei fattori a valle di

CaMKKII, quando viene attivato CaMKII attiva una cascata di cui fa parte questa

proteina staufen.

Quindi dopo la stimolazione con nicotina si ha l'aumento dell'espressione di

staufen (non so perche non è riportato nell'esperimento comunque anche

dell'espressione di CaMKII). Qual'è il meccanismo attraverso il quale la nicotina

armitage

aumenta l'espressione di CaMKII? È il giocatore coinvolto, perché in

presenza di attivazione, si ha una degradazione di questa proteina armitage. Si

dimostra che questa proteina è degradata dal proteasoma, viene utilizzato qui

un inibitore del proteasoma che è questa lactacystin (vedi sopra). La nicotina

determina rispetto al wylde-type la degradazione di armitage. Se si utilizza un

inibitore del proteasoma, i livelli di armitage ritornano su, e la nicotina induce la

traduzione di CaMKII e questo effetto viene antagonizzato dall'inibitore del

proteasoma. L'attivazione sinaptica (in questo caso in un processo di

consolidamento della memoria) passa attraverso la traduzione di proteine quali

CaMKII ma non solo, KHC che è una proteina del citoscheletro e staufen. È

necessaria la traduzione di queste proteine localmente in presenza di

attivazione sinaptica. Perché queste proteine sfuggano al controllo di RISC, in

condizioni di attivazione sinaptica,RISC è inattivo. L'inattivazione di RISC è

mediata dall'inattivazione di uno dei suoi fattori che è armitage (MOV10 nei

mammiferi) a carico del proteasoma. (cioè in assenza di attivazione sinaptica i

livelli di CaMKII e di altre proteine del pathway sono bassi, questo perché RISC

in assenza di attivazione sinaptica inibisce la traduzione di elementi di questa

cascata di segnale. Dopo attivazione sinaptica viene rimossa l'inibizione di RISC

attraverso la degradazione di uno degli effettori del silenziamento da parte di

RISC che è armitage e questo avviene per degradazione di armitage). Questo

lavoro è molto importante perché sottolinea la plasticità di RISC che può essere

modificato, rimosso o attivato.

Torniamo ai microRNA presenti localmente e vediamo quali sono. Abbiamo

detto che sono stati caratterizzati in relazione ai microRNA espressi. Qui è

riportato un vecchio lavoro su mammiferi che spiega bene la distinzione tra

microRNA ubiquitari che sono presenti ovunque e non sono la maggioranza, e

microRNA che hanno un'espressione diversa nei diversi tessuti e sono arricchiti

in certi organi. Ad esempio qui è rappresentata per northern blot l'espressione

del microRNA LET-7 che è ubiquitario ma non è espresso allo stesso modo in

tutti tessuti, e in questo caso è arricchito nel cervello dov'è espresso

maggiormente. LET-7 È un microRNA neuro-arricchito (neuronal enriched). Tra

tutti quelli identificati molto importante è la percentuale di quelli neuro-

arricchiti. Poi ci sono dei microRNA come il miR-124 che è espresso solo nel

cervello e dà quindi segnale nullo in qualunque altro organo. Anche i microRNA

specifici espressi solo in un tessuto in particolare nel tessuto neuronale sono la

fetta più grande dei microRNA tessuto-specifici.

Qui ho riportato un microarray in cui si studia la specificità dell'espressione dei

microRNA in diverse aree del cervello per cui non solo certi miR neuronali sono

neuro-specifici ma la loro espressione cambia nelle diverse aree del cervello. In

questa rappresentazione l'espressione relativa maggiore corrisponde al colore

rosso (in questo caso nell'ippocampo relativamente all'espressione media in

tutti tessuti neuronali).

Questo a dire che questa famiglia di miR è ippocampo-specifica. Alcuni di essi

sono anche specifici per il bulbo olfattivo. Tra questi microRNA ce ne sono

alcuni che sono espressi solamente nei dendriti, sono una famiglia piccola e qui

ne sono riportati alcuni, noi parleremo in particolare del miR-124 e del miR-

134. Di questi micro-RNA si sa che regolano dei target, nel caso del miR-132 e

134 si sa che regolano dei messaggeri coinvolti nel controllo della maturazione

delle sinapsi, in particolare proteine o chinasi o piccole proteine legate alle

proteine G che sono coinvolte nella maturazione del citoscheletro delle sinapsi.

Questa è una tabella riassuntiva che ci serve solo a dire che di questi micro-

RNA a localizzazione dendritica, alcuni sono stati associati proprio alla


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13

PESO

1.17 MB

AUTORE

ludide

PUBBLICATO

6 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in neurobiologia
SSD:
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher ludide di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Neurobiologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università La Sapienza - Uniroma1 o del prof Presutti Carlo.

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