Ruolo dei microRNA nella plasticità sinaptica

Drosophila passa attraverso il sistema colinergico per cui viene attivato dalla

staufen,uno

nicotina e quello che è stato visto è che dei fattori a valle di

CaMKKII, quando viene attivato CaMKII attiva una cascata di cui fa parte questa

proteina staufen.

Quindi dopo la stimolazione con nicotina si ha l'aumento dell'espressione di

staufen (non so perche non è riportato nell'esperimento comunque anche

dell'espressione di CaMKII). Qual'è il meccanismo attraverso il quale la nicotina

armitage

aumenta l'espressione di CaMKII? È il giocatore coinvolto, perché in

presenza di attivazione, si ha una degradazione di questa proteina armitage. Si

dimostra che questa proteina è degradata dal proteasoma, viene utilizzato qui

un inibitore del proteasoma che è questa lactacystin (vedi sopra). La nicotina

determina rispetto al wylde-type la degradazione di armitage. Se si utilizza un

inibitore del proteasoma, i livelli di armitage ritornano su, e la nicotina induce la

traduzione di CaMKII e questo effetto viene antagonizzato dall'inibitore del

proteasoma. L'attivazione sinaptica (in questo caso in un processo di

consolidamento della memoria) passa attraverso la traduzione di proteine quali

CaMKII ma non solo, KHC che è una proteina del citoscheletro e staufen. È

necessaria la traduzione di queste proteine localmente in presenza di

attivazione sinaptica. Perché queste proteine sfuggano al controllo di RISC, in

condizioni di attivazione sinaptica,RISC è inattivo. L'inattivazione di RISC è

mediata dall'inattivazione di uno dei suoi fattori che è armitage (MOV10 nei

mammiferi) a carico del proteasoma. (cioè in assenza di attivazione sinaptica i

livelli di CaMKII e di altre proteine del pathway sono bassi, questo perché RISC

in assenza di attivazione sinaptica inibisce la traduzione di elementi di questa

cascata di segnale. Dopo attivazione sinaptica viene rimossa l'inibizione di RISC

attraverso la degradazione di uno degli effettori del silenziamento da parte di

RISC che è armitage e questo avviene per degradazione di armitage). Questo

lavoro è molto importante perché sottolinea la plasticità di RISC che può essere

modificato, rimosso o attivato.

Torniamo ai microRNA presenti localmente e vediamo quali sono. Abbiamo

detto che sono stati caratterizzati in relazione ai microRNA espressi. Qui è

riportato un vecchio lavoro su mammiferi che spiega bene la distinzione tra

microRNA ubiquitari che sono presenti ovunque e non sono la maggioranza, e

microRNA che hanno un'espressione diversa nei diversi tessuti e sono arricchiti

in certi organi. Ad esempio qui è rappresentata per northern blot l'espressione

del microRNA LET-7 che è ubiquitario ma non è espresso allo stesso modo in

tutti tessuti, e in questo caso è arricchito nel cervello dov'è espresso

maggiormente. LET-7 È un microRNA neuro-arricchito (neuronal enriched). Tra

tutti quelli identificati molto importante è la percentuale di quelli neuro-

arricchiti. Poi ci sono dei microRNA come il miR-124 che è espresso solo nel

cervello e dà quindi segnale nullo in qualunque altro organo. Anche i microRNA

specifici espressi solo in un tessuto in particolare nel tessuto neuronale sono la

fetta più grande dei microRNA tessuto-specifici.

Qui ho riportato un microarray in cui si studia la specificità dell'espressione dei

microRNA in diverse aree del cervello per cui non solo certi miR neuronali sono

neuro-specifici ma la loro espressione cambia nelle diverse aree del cervello. In

questa rappresentazione l'espressione relativa maggiore corrisponde al colore

rosso (in questo caso nell'ippocampo relativamente all'espressione media in

tutti tessuti neuronali).

Questo a dire che questa famiglia di miR è ippocampo-specifica. Alcuni di essi

sono anche specifici per il bulbo olfattivo. Tra questi microRNA ce ne sono

alcuni che sono espressi solamente nei dendriti, sono una famiglia piccola e qui

ne sono riportati alcuni, noi parleremo in particolare del miR-124 e del miR-

134. Di questi micro-RNA si sa che regolano dei target, nel caso del miR-132 e

134 si sa che regolano dei messaggeri coinvolti nel controllo della maturazione

delle sinapsi, in particolare proteine o chinasi o piccole proteine legate alle

proteine G che sono coinvolte nella maturazione del citoscheletro delle sinapsi.

Questa è una tabella riassuntiva che ci serve solo a dire che di questi micro-

RNA a localizzazione dendritica, alcuni sono stati associati proprio alla

maturazione dei dendriti, ma non solo, alla maturazione proprio delle sinapsi

attraverso il controllo di target specifici che abbiamo detto essere protein

chinasi e GTP-asi, Rho-GTPasi che sappiamo essere coinvolte in processi di

riduzione delle spine dendritiche, quindi contrazione del citoscheletro, mentre

protein chinasi come LimK1, piuttosto attivano la polimerizzazione del

citoscheletro perchè contrastano l'effetto di fattori negativi della

polimerizzazione. Quindi i micro-RNA 132 e 134 ma anche 138 e 124 come

vedremo controllano la maturazione delle spine attraverso un controllo della

struttura del citoscheletro. In particolare il miR-134 è il pioniere di questa

osservazione. Questa è la figura dell'altra lezione in cui abbiamo descritto che

cosa succede nelle sinapsi durante l'attivazione sinaptica a livello quindi delle

spine dendritiche, come l'attivazione di recettori di membrana, per legame del

ligando specifico che può essere BDNF o glutammato, può scatenare una serie

di segnali a valle che portano sia all'aumento della traduzione generale alle

spine dendritiche, sia a un aumento della traduzione di specifici messaggeri

che sono presenti alle sinapsi però in una forma silente. (nella lezione

precedente abbiamo parlato dell'effetto in questo controllo traduzionale locale

di proteine che legano l'RNA e abbiamo visto come il signalling che passa

attraverso le chinasi modifica effettori negativi della traduzione e rimuove il

blocco sul messaggero che può essere tradotto. Questi sono effettori negativi

della traduzione proprio come i micro-RNA).

Vediamo ora il micro-RNA 134 che è un effettore negativo della traduzione

sinaptica e l'attivazione sinaptica mediata da recettori quali in questo caso

recettori TRK(B) e del BDNF porta alla rimozione del blocco da parte del miR-

134 e quindi all'induzione della sintesi della protein-chinasi LimK1.

Ripercorro questo esperimento più nel dettaglio che descrive cosa facessero i

miR-134 alle sinapsi. In una caratterizzazione generale il miR-134 è neuro-

specifico cosi come il 124. Osservando il northern blot vediamo che

l'espressione del miR-134 è debole; questo miR è uno dei miR chiave nella

maturazione dei dendriti ma è espresso pochissimo ed è difficile vederlo, infatti

solo un laboratorio di questa portata è riuscito a mettere su esperimenti che ne

rivelassero la presenza.

Quindi rispetto al 124 che è molto espresso, l'espressione del 134 aumenta

durante lo sviluppo. Questi sono neuroni ippocampali a giorni diversi di colture

in vitro.

I sistemi di colture primarie di neuroni ippocampali per esempio, è un sistema

modello di differenziamento neuronale perchè le cellule prelevate (da aree

dell'ippocampo nell'embrione) ricapitolano i processi di differenziamento e

quindi da una forma globulare iniziano a sviluppare neuriti e quindi dendriti

assoni ecc. Quello che quello che si è visto dopo 18 giorni di divisione, c'è

un'espressione piuttosto importante del miR-134 (il miR-124 viene espresso

molto precocemente nello sviluppo embrionale). Il miR-134 è arricchito nei

sinaptosomi. Questo miR se viene over-espresso nei neuroni ippocampali

modifica lo sviluppo delle sinapsi e gli autori sostengono che l'effetto negativo

sia sulla dimensione delle spine. Nel controllo le spine hanno una forma

globulare, dopo l'espressione del miR-134 Si ha una forma dislunga che è

specifica del 134 perché se io antagonizzo il suo effetto con un anti-miR ritorno

ad una struttura globulare delle spine. Questa attività sulla maturazione delle

LimK1

spine gli autori la associano alla protein-chinasi che come dicevamo è un

cofillina

effettore positivo della maturazione del citoscheletro perché fosforila la

che è un inibitore della polimerizzazione dell'actina. Quindi LimK1 aiuta la

maturazione del citoscheletro dei dendriti. Questa è la predizione che noi

abbiamo visto è possibile fare mediante algoritmi per bio-informatica e quindi il

miR-134 forma questa consensus di struttura con la 3'-UTR del messaggero di

LimK1 e colocalizza perche questa è un ibridazione in situ e una

immunocitochimica per la proteina LimK1, quello che si vede è una

colocalizzazione individuata dal segnale giallo.

Questa interazione è un interazione attiva, funzionale, e infatti in un saggio di

luciferasi la over-espressione del miR-134 porta a down-regolazione del

costrutto reporter che dipende dalla presenza di questa sequenza proprio nel

messaggero, e se questa sequenza viene mutata (vediamo il mutante m191, il

mutante della sequenza target, quindi il mutante del messaggero) l'effetto è

revertito.

Questa down-regolazione è evidente anche sulla proteina e quindi sul western

blot, la trasfezione di dosi crescenti del miR porta ad una down-regolazione

della proteina. Questa induzione di LimK1 passa attraverso la fosforilazione di

protein-chinasi, quindi attivazione sinaptica via BDNF porta ad un aumento

della proteina LimK1 e questo effetto è annullato dal trattamento con

rapamicina, questo ci dice che è mTor la chinasi che viene inibita dalla

rapamicina. Ora il realtà qui si ferma il lavoro con la definizione del ruolo del

miR nel controllo di LimK1 in seguito a stimolazione con BDNF, ma non si parla

di effetto del BDNF sulla sintesi dei micro-RNA.

L'ultimo esperimento è quello qui riportato in cui trasfettando le cellule con il

costrutto reporter di Limk1 (che loro hanno utilizzato per il saggio di luciferasi)

che contiene le sequenze target dei micro-RNA e nella forma wilde-type e nella

forma mutata che non possono più legare i miR, cellule (in questo caso neuroni

ippocampali) stimolati da BDNF presentano un aumento dell'espressione del

reporter e quindi di Limk1 che è mediato dall'azione del miR perchè il mutante

non viene più indotto. In questo caso quello che si vede è che l'induzione del

LimK1 In seguito al trattamento con BDNF, non solo è contrastata dalla

presenza di mutazioni ma anche dall' over-espressione del miR. Quindi

defini