Ruolo dei microRNA nella plasticità sinaptica

Ruolo dei micro-RNA nella plasticità sinaptica

Controllo dell'espressione genica locale

Parleremo del contributo dei microRNA al controllo dell'espressione genica locale, quindi di neuroni post-sinaptici facendo riferimento in particolare a quel controllo spaziale che nel sistema nervoso avviene a diversi livelli per quanto riguarda l'espressione genica.

Qui vediamo un sunto che sta a sottolineare come, da studi ormai storici, si sappia che la sintesi proteica è indispensabile nei processi di plasticità. Quindi, per consolidare la memoria è necessaria sintesi proteica e quindi inibitori della sintesi proteica che interferiscono con il consolidamento della memoria.

Sappiamo che la sintesi proteica può avere un controllo locale attraverso meccanismi qui schematizzati. La sintesi locale viene attivata in seguito all'attivazione sinaptica che porta, by-passando il controllo trascrizionale, al granuli trasporto dell'RNA messaggero in strutture che abbiamo descritto come ad RNA, lungo il dendrite e sui microtubuli grazie al contributo di proteine motrici, e poi al livello della singola spina dendritica lungo il citoscheletro.

Le chinesine e le miosine sono i motori molecolari che aiutano il granulo a scorrere lungo il microtubulo. Quindi l'attivazione sinaptica attiva questo processo che porta il messaggero in questa forma, di complesso ribonucleoproteico alla spina dendritica.

Complesso ribonucleoproteico e fattori di controllo

Abbiamo visto che questo complesso vede il messaggero in una forma silente, questo per il legame al messaggero di proteine RBP che legano l'RNA e nella maggior parte dei casi hanno un effetto repressivo sulla traduzione (quindi sull'espressione di questo RNA messaggero). L'attivazione sinaptica rimuove la repressione traduzionale a opera delle proteine RBP, quindi ci sono dei processi che passano attraverso l'attivazione di segnali a cascata (protein-post-synaptic-density chinasi) che modificano in questo caso molti fattori del (PSD), permettono la liberazione dal messaggero e quindi la sua traduzione.

Abbiamo riassunto questo processo per dire che l'attivazione sinaptica induce attivazione traduzionale locale attraverso la rimozione di fattori che regolano questo processo di sintesi.

Ruolo dei microRNA

Vediamo il ruolo di altri fattori di controllo della traduzione quali, ad esempio, i microRNA. L'osservazione da cui si parte per poi determinare il ruolo dei microRNA nell'attività sinaptica è la presenza del complesso ribonucleoproteico mi-RISC a livello delle spine dendritiche (in particolare del PSD) di cui facevano parte microRNA legati a messaggeri quindi mai liberi.

MicroRNA a single strand non lo troverete mai libero nelle cellule perché verrebbe degradato. Sempre a questo livello sono presenti altri fattori dell'apparato dei microRNA che sono la proteina DICER, e anche proteine che modulano l'attività di DICER e di RISC come FMR1.

Il microRNA che abbiamo detto essere presente in singola elica ma associata al messaggero in questa sede, è presente in forma di double-stranded e sotto forma di hairpin; questi vedremo sono i precursori del miR maturo 1 e 2. Quindi la prima osservazione è la presenza di RISC, piccoli RNA oltre ai messaggeri in prossimità del PSD.

Biogenesi dei miR

Il pre-miR è il primo prodotto di maturazione di taglio di una prima Rnasi di tipo III che riconosce il trascritto primario. Il pre-miR è trasportato lungo il poro nucleare e poi nel citoplasma si ha un secondo step di maturazione a opera di DICER che lavora in concerto con altri fattori.

Quindi il complesso attivo nella repressione trascrizionale è il complesso di RISC che può mediare due effetti distinti: un effetto è quello dipendente da un appaiamento del microRNA con il suo target sul messaggero (nella 3'-UTR) e questo effetto media il taglio endonucleolitico da parte di una proteina Ago (Ago2) di RISC. È quindi la modalità di interazione del microRNA con il suo messaggero target che conduce a un effetto finale, che è la degradazione immediata, oppure nel caso in cui l'interazione non sia perfetta, a un silenziamento genico che può eventualmente portare alla degradazione dell'RNA.

Nel sistema nervoso RISC ha una composizione particolare, esistono tanti tipi di RISC, qui parliamo di mi-RISC quindi un complesso ribonucleoproteico che collabora al funzionamento della repressione traduzionale mediata dai miR.

Nel caso del sistema nervoso fanno parte di RISC proteine come FMR1 e proteine che legano l'RNA come Pum2. Altri fattori sono fattori comuni a tutti RISC e che sono le proteine Agoda 1 a 5, la proteina MOV10, che è una elicasi che aiuta i miR ad entrare in RISC, e un'altra elicasi DDX6.

Interazione e meccanismi di azione dei microRNA

Il meccanismo nel caso in cui ci sia un'interazione parziale del miR con il messaggero target passa tramite inibizione traduzionale. I microRNA interagiscono con il messaggero secondo una consensus di struttura e questa vede a livello del 5' del microRNA un'elica di una misura variabile di 7-8 paia di basi che si forma quindi con il messaggero target con presenza di specifici nucleotidi in corrispondenza della posizione 1 del miR e della posizione 9 sul messaggero.

Quindi una regione di mis-paring (non appaiamento) e una regione al 3' di appaiamento incompleto che non ha una dimensione fissa e che è meno rilevante. Quindi questa è stata descritta come seed-region. Il fatto che ci sia una consensus di struttura nell'interazione tra il microRNA e il messaggero, il fatto che sia una regione necessaria di base-paring con il messaggero che è la seed-region, ha permesso di elaborare degli algoritmi per la predizione dei possibili target.

Esistono algoritmi che si basano su parametri diversi. Algoritmi che riguardano di più l'avidità del legame tra la seed-region e il messaggero o algoritmi che danno un punteggio maggiore alla struttura secondaria dello stem-bulge-stem, algoritmi che danno un punteggio maggiore all'identità di questi nucleotidi di cui abbiamo parlato.

Comunque, in generale, la predizione bioinformatica è uno strumento chiave per l'identificazione dei target e quindi la loro validazione in vivo. Sempre riguardo ai miR era la loro maturazione, qui è riportata semplicemente la struttura del messaggero del miR che può essere anche un'unità indipendente come in questo caso ossia ha un suo gene con le sue sequenze regolatrici per dare un trascritto primario (che viene trascritto normalmente da una RNA polimerasi di tipo II) che ha un cap al 5' e una coda di poli (A).

In altri casi i miR possono essere interagenici quindi fanno parte in questo caso di un altro gene e normalmente occupano le regioni introniche, in questo caso i miR sfruttano le regioni regolatrici del gene e la loro maturazione rientra nei processi di splicing dell'RNA messaggero. Queste sono le due situazioni più classiche e ce ne sono altre, ma la cosa più importante è che i microRNA possono avere le loro sequenze regolatrici.

Complesso mi-RISC e meccanismi di silenziamento

Il meccanismo post-trascrizionale operato dal complesso mi-RISC è qui rappresentato come un complesso ribonucleoproteico, quindi come proteine sedute sulla 3'-UTR dell'RNA messaggero contenente le MTS (miR target sequence), questo complesso normalmente non è libero nella cellula, ma fa parte di strutture cui afferiscono altri fattori, in questo caso legati alla traduzione, al processamento, di natura diversa a seconda del tipo cellulare e del momento particolare.

Questa struttura entrando a far parte dei P-body (corpi di processamento), porta a un silenziamento del messaggero e il silenziamento viene fatto da meccanismi di blocco dell'inizio di traduzione, quindi, interazione del mi-RISC con il fattore eucariotico di inizio della traduzione (EF4e) o un'inibizione dell'allungamento della traduzione, la traduzione può partire ma il RISC ne blocca l'allungamento della proteina.

Molto spesso all'effetto traduzionale dei miR segue una degradazione dell'RNA messaggero e questo si pensa in generale che sia legato al fatto che i polisomi liberano parzialmente il messaggero e quindi questo viene degradato perché può essere attaccato da RNasi (esonucleasi 3'-5'). Questo è il meccanismo d'azione più classico. Il mi-RISC neuronale contiene alcune proteine specifiche del sistema nervoso, alcune espresse solamente nel sistema nervoso, e qui sono rappresentate da FMR1 e Pum2.

Dicevamo che RISC non è libero, ed è possibile individuarne la presenza all'interno dei granuli in particolare dei P-body. Vorrei ricordare MOV10 di cui parleremo in seguito, che corrisponde ad armitage di Drosophyla, è una elicasi fondamentale per il funzionamento di RISC perché media il caricamento di una delle due eliche double-stranded dell'RNA nel RISC, ed è presente nel sistema nervoso.

Riporto esperimenti chiave di lavori chiave sull'argomento specifico in seguito. Le pubblicazioni nell'ambito dei miR sono infinite, ho utilizzato quelle che sono definiti i lavori più importanti. Questo lavoro (SLIDE: P-body e Dendrites of Mammalian Neurons Contain Specialized P-attivazione sinaptica; Body-Like Structures That Respond to Neuronal Activation) ha messo a fuoco la presenza dei P-body nei neuroni perché non era chiaro; si sapeva che i P-body contengono fattori di RISC e anche microRNA, messaggeri e in questa conformazione sono presenti nei neuroni (qui c'è una marcatura e sono i puntini gialli, con due anticorpi, uno per proteine specifiche dei P-Body quindi della degradazione dei messaggeri.