RNAi Interference

UBIQUITINAZIONE:

• il legame dolente a una proteine prevede una cascata enzimatica

◦ E1: attiva Ub

◦ E2: coniuga Ub ( la lega )

◦ E3: lega Ub al substrato

Il sistema deve riconoscere le proteine per poterle avviare alla degradazione: MA come si fa a riconoscere tanti

substrati diversi ?

Il primo passaggio è uguale per tutti i substrati, l ' Ub si lega a E1 formando un legame tioestere tra una

cisteina di E1 e il gruppo COOH della glicina terminale dell'Ub. Il processo però è un pò più complesso:

• ATP lega E1

• Ub si lega a ATP legato a E1

• Idrolisi di ATP in AMP, Ub si lega a SH ( di E1 )

• Si ripete di nuovo il passaggio 1 e 2 ma l'UB resta attaccato a AMP

Il secondo passaggio:

• Ub legata a E1 passa a E2 attraverso una trans-esterificazione

• Questi E2 hanno un UBC che contiene la cisteina per legare Ub

Il terzo passaggio:

• trasferimento dell'ubiquitina al substrato , questo passaggio varia al variare del tipo di E3:

◦ Famiglia RING

◦ Famiglia HECT

HECT

• come si fa a fare il passaggio di Ub da E2 a E3, questo perchè c'è un loop che fa da cardine portando il

domino HECT in prossimità dell'ubiquitina

RING

• più complesso , ma non è chiaro il funzionamento, trasferiscono direttamente Ub da E2 a substrato

• caso più semplice: E3 costituito da un singolo polipeptide Mdm2; ha un dominio di legame per il substrato,

un dominio RING FINGER che prende R2 e lo avvicina ( con cambio conformazionale ) al substrato

• ma spesso le E3 RING sono a sub-multiple: ci sono proteine cullin che interagiscono il Ring Finger e

possono interagire direttamente o indirettamente con il substrato.

Quali delle tante lisine del substrato vengono ubiquitinate:

• talvolta è random , talvolta è specifico ma non è stato decodificato una sequenza consenso, in rari casi in cui

tolgo tutte le lisine, può essere ubiquitinate la metionina amminoterminale.

• Una volta che il substrato è ubiquitinato, si crea una catena di ubiquitine, perchè le lisine dell'ubiquitina ( ce

ne sono 7 diverse ) sono a loro volta ubiquitinate

• La poliubiquitina ione su alcune lisine è molto rara, altre sono piuù frequenti come la lisina 48

Una proteina può essere mono ubiquitinate in tante lisine diverse, possiamo avere una poliubiquitinazione:

• omotipica ( sempre la stessa lisina )

• Mista ( sono coinvolte lisine diverse )

• Eterologa ( mista e con modificazioni diverse )

Talvolta sommo state individuate proteine accessorie che intervengono per la poliubiquitinazione ( E4 ), più

spesso sono i demoni E3 che formano oligo eri e possiedono RING multipli per formare la poliubiquitinazione,

spesso E3 può essere ubiquitina, attivandomi per ubiquitinare il substrato.

Una proteina ubiquitinate può essere de-ubiquinata da enzimi chiamati DUB, vanno a eliminare gli enzimi che

attivano il taglio proteolitico della poli ubiquina o della Ub fusa a proteine ribosomiali. Possono accorciare le

catene di poliUb, possono rimuovere l' Ub dal substrato , possono riciclare le singole molecole di ubiquitine di

poliUb.

Nei mammiferi ci sono fino a 100 Ub.

1) UCH: DUB. Che rimuovono i peptidi C-terminali della proteina di fusione

2) UBP: smontano le catene di ubiquitina dal substrato per poterla riciclare.

L'unico segnale che porta all degradazione attraverso il proteosoma è 4-Ub sulla lisina K48 o più. Altre lisine

Ub possono rappresentare segnali per fare qualcosa altro.

Sumoilazione

La proteina Sumo ha una struttura simile a quella della Ub, è codificata da 4 geni diversi che fanno Sumo

diverse. Sumo 2 e Sumo 3 sono molto conservati, Sumo 4 assomiglia a Sumo 2 e 3, ma non se ne conosce

l'attività biologica.

Sumo è espressa in tutti gli eucarioti. È leggermente più grande dell'ubiquitina , ha una migrazione anormale

sul gel di poliacrilammide, sembrando più pesante di quella che in realtà è. Anche le proteine SUMo sono

trascritte come precursori con un'estremità C terminale che termina con due Glicine ( fondamentali per la

coniugazione )

Nel lievito se elimino Sumo , le cellule hanno difetti nello sviluppo, mentre nei topi osserva vo mortalià

embrionale.

Le proteine Sumo hanno un processo simile a quello dell'ubiquitinazione, abbiamo vari enzimi che servono a

trasferire sul substrato , Sumo. Sumo1 fa monosumoilazione , mente Sumo 2 e 3 fanno proteine poli

sumoilata . Anche qui avviene sulla lisina. Il sito Attivo termina con 2 G, il taglio proteolitico lo fa SENP

( sentin-protease ). La coniugazione necessità delle due GG e di ATP ,e avviene tra G e la cisteina della

proteina Uba2 ( analogo E1 ) e poi viene trasferito a UBC9 ( E2 ) a questo punto viene trasferito sul substrato,

ma questo passaggio non è diverso , in cui il E si lega alla lisina del target.

SUMO-E3-ligasi ( che causa il passaggio di Sumo sul substrato ) :

1. SP-RING: possono legare sia UBC9 che substrato, si ha anche qui un transito diretto sul substrato, a questa

famiglia appartengono le proteine PIAS

2. RamBP2 ( fa parte dei pori nucleari ) è anche in grado di sumoilata alcuni substrati , tra cui RANGAP e

coinvolge anche Ubc9

3. PC2 ( gene silencing )

4. HDAC4

Quali lisine vengo no modificate ?

Qui esiste una sequenza consenso:

• psi: amminoacidi grandi e idrofobici

• K: lisina

• X: variabile

• E: amminoacido glutammico

Esperimento in cui la proteina è over espressa in un gel sistema cellulare e verificarne la Sumoilazione, ciò si

evince da una banda corrispondente al suo peso molecolare e una banda con un maggior peso molecolare. Per

verificarlo quello che sui può fare è mappare il sito di Sumoilazione e vedere che se li blocco ( nel modo più

semplice , posso eliminare la lisina ) e vedere se non ho più quelle bande con peso molecolare più alto rispetto

a quello della mia proteina scelta.

Il consenso canonico di Sumoilazione è caratterizzato dal consenso : psi-lisina-amminoacidoqualsia-

amminoacidoglutammico

Man mano che i substrati della Sumoilazione aumentavano, si è visto che oltre al consenso canonico ci sono

altre sequenze che sono importanti per la Sumoilazione.

Ad esempio il PDSM: phosphorylatio-dipendente-sumoilation-motiv

Si hanno a distanza di due amminoacidi dal consenso canonico si hanno due amminoacidi che sono

fosforilabili li ( S e P ) oppure delle cariche negative ( NDSM ) . Sono entrambi dei modi per portare delle

cariche negative vicino al consenso ( che di solito è carico negativo ). Quindi sono una conferma che quella

sequenza consenso sia effettivamente sumoilabile.

Immunoprecipitando tutte le proteine Sumo, si è andata a vedere quali fossero tutte le proteine sumoilate e in

generale vedere quante proteine sono sumoilate sul consenso canonico e quali no.

Il :

• 48% contiene il Sumo Canonico ( FILMV = Psi , ossia amminoacidi ingombranti e idrofobici )

• 22% sono sumoilate in un consenso diverso

◦ Degenerato : rispetto da quello canonico

◦ Sumo Canonico invertito

• 22% sequenze random

Non tutte le volte che c'è un consenso canonico vuol dire che che venga sumoilato.

Per questo per vedere se ciò avvenga, bisogna fare un tipo di esperimento come sopra descritto.

Perchè verificarne la Sumoilazione? Perchè vuol dire che la Sumoilazione è un importante meccanismo

dell'attività biologica e quindi ne regolarebbe la funzionalità.

In che modo ne regola la funzione ? Non è sempre possibile dire che effetto avrà. Mentre è possibile farlo per

l'ubiquitinazione, per la Sumoilazione si hanno effetti che variano da proteina a proteina.

In generale gli effetti possono influire sulla funzione, la posizione cellulare e la stabilità. Quello che succede

con la Sumoilazione è che cambia l'interazione della proteina con altre macromolecole.

La proteina sumoilata , mentre prima poteva interagire con la proteina A ( ad esempio un dominio di

attivazione ), va a interagire con la proteina B, questo perchè quest'ultima interagisce in parte con Sumo.

Generalmente la proteina sumoilata , comunque, non subisce un cambio conformazionale. In casi più rari la

Sumoilazione provoca un cambio conformazionale e questo è responsabile dell'arte razione della funzione.

I domini di legame a Sumo usati dalla proteina B ( SIB / SIM ) , interagiscono con Sumo in modo non

covalente :

• Breve sequenza idrofobicia ( 3-4 residui alifatici spesso valine o isoleucine )

• Affiancati all' N o C terminale residui acidici o Serine

Il sito di legame a Sumo ( SIM ) in conformazione a foglietto beta si frappone tra uno dei beta-grasp e l' alpha-

elica. Questi domini SIM hanno per Sumo un'affinità molto bassa, allora come avvine questo ?

La proteina target sumoilata funziona come un secondo dominio di interazione per la proteina B. C'è quindi un

doppio legame è conferisce anche specificità ( c'è un doppio controllo, per evitare che vengano riconosciute

tutte le proteine sumoilate ).

La Sumoilazione è un processo che è quasi sempre altamente inefficiente, in vivo con western blot, nella stra-

grande dei casi la Sumoilazione non la vedo, ad esempio PEG3.

Quindi la proteina pur essendo sumoilabile , non avviene sempre. Il numero di molecole modificate dalla

Sumoilazione avviene in un percentuale davvero bassa, ma gli effetti sono drastici. In vivo, RanGap è una delle

poche proteine che si vedono sumoilate in Vivo.

I bersagli sono rapidamente sumoilate e altrettanto de-sumoilate, questo perchè le proteine de-sumoilanti sono

altamente efficienti e per questo noi ne vediamo poca ma osserviamo un effetto visibile. All'equilibrio si tende

più verso le proteine de-sumoilate rispetto a quelle sumoilate.

Un esempio , un fattore di trascrizione che quando è sumoilato può reclutare fattori di modificazione della

cromatina come HDAC, questo avviene e poi , la proteina, viene de-sumoilate. Quello che vedo è il fattore di

trascrizone non sumoilato ma vedo che la cromatina è stata modificata e quindi la sumoilazione è avvenuta

velocemente e ha lasciato un segno del suo passaggio.

Un altro esempio è la proteina di inibizione Daxx, la cui Sumoilazione è Desumoilazione avviene nello stesso

modo.

Un altro esempio lo vediamo nel riparo del danno del DNA, dove la Timina DNA Glicosilasi ( TDG ) si lega a

un mismatch sul DNA e la base è escissa.

Si forma così un sito a basico che trattiene TDG perchè ha un'alta affinità.

La Sumoilazione di TDG provoca un cambio conformazionale che ne permette il rilascio.

Una isopepttidasi rimuove immediatament