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RNAi Interference

Appunti di biologia molecolare degli eucarioti su RNAi Interference basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Ambrosetti dell’università degli Studi di Bologna - Unibo, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Biologia molecolare degli eucarioti docente Prof. D. Ambrosetti

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instabili

2. un loop terminale , a destra

3. un segmento basale: una regione a singolo filamento

Drosha taglia circa a due giri d'elica dal loop e a un giro dal segmento basale .

Si vede che lo stelo è più stabile a partire dalla posizione + 3 e meno stabile a partire dalla

parte centrale ( da + 9 a + 12 )

5' donors: la posizione più instabile è la +1, coerentemente con la necessità funzionale di avere

un 5' più instabile

3' donors: si vede che le +19 e +20 sono generalmente più instabili che quelli in +1 e

2

Si vuole studiare Posha e Drosha per vedere come viene processato il priRNA e pre-miRNA

Scelgono uno dei primiRNA ( detto minimal ) che viene marcato sia al 5' che internamente, poi

viene processato con Drosha e DGCR8.

Come fanno a escludere Dicer per evitare che il premiRNA venga poi direttamente processato

in miRNA?

Li immunoprecipitano dal lisato cellulare isolandoli con anticorpi anti-FLAG ( con cui erano

marcati ).

Si hanno di nuovo tre frammenti più grandi, e si prende quello da 65 nt.

Ci si chiede se sia importante il loop, per avere il processamento corretto.

E si vede che andando a tagliando il loop ,(da cui si ottengono due filamenti, perchè non sono

più tenuti assieme dal loop ) il processamento avviene comunque, ma con una minore

efficienza.

Provano a fare un priRNA il cu loop è a sinistra e non a destra e il punto nodale è al lato

opposto, ancora una volta

il processamento avviene

ma con minore efficienza.

Quindi , il loop andrebbe

a influire sull'efficienza,

ma non sulla possibilità

do avere o meno il

processamento.

Ci si inizia a chiedere se

sia necessaria la Regione

Basale

Fanno un mutante

( DeltaBS ) in cui viene

eliminato il segmento

basale , e si ha un

mutante che manca solo

del 5' basale e un altro

che manca solo del 3' basale. E si vede che se manca un solo filamento , il processamento

avviene comunque. Se mancano entrambi i singoli filamenti del segmento basale, si vede che il

processamento non avviene ( nel gel A, non si vede il frammento da 65 nt a livello del

DeltaBS).

Fanno un ulteriore esperimento, invece di eliminare il segmento basale, fanno appaiare

entrambi i filamenti basali a catene di oligonucleotidi. Ottenendo così due dsRNA a livello del

segmento basale e si vede che il

processamento non avviene ( nel

gel B non si vedono bande tra

21-23 nt ) .

Viene così confermata la

necessità di avere a livello del

segmento basale, almeno un

filamento singolo.

Infine ( gel C ) modificano le

sequenze del segmento basale in modo tale che si appaino tra loro formando una regione

double strand. In questo caso si osserva una banda più chiara li dove dovrebbe esserci il

frammento da 65 nt.

Queste variazioni, in ogni caso, non modificano il miRNA che si originerà, in quanto il sito di

taglio non è coinvolto!

Vediamo che il sito di taglio, identificato facendo appaiare il miRNA con il pri-miRNA ( per

vedere quale era la regione corrispondente ), è caratterizzato da una struttura stelo/forcina

( stem loop ) di 30 nt, con un upper stem da 20 nt e un lower stem da 10 nt.

Curiosamente, sono

tutti multipli di 10,

ossia quanto il normale

giro dell'elica ( di DNA

)

Quindi:

• 10 nt= 1 giro

dell'elica

• 20 nt= 2 giri

dell'elica

Vogliono sapere dove inizia e dove finisce, di preciso, lo stem loop.

Cominciano a fare delle delezioni del lower steem.

Se tolgono 4 bp dal wild type, il processamento avviene ma si sposta di 4 nt verso destra!

Ossia, sempre a 10-11 nt dal segmento basale! Quindi, la struttura, tende a mantenere invariata

la distanza tra sito di taglio e segmento basale.

Vanno a provare a far modificazioni a livello dell'upper steem ( a uno tolgono 2 nt, a un altro

aggiungono 2 nt ) ma non si assiste a spostamenti del sito di taglio.

Modificare , quindi, la distanza tra sito di taglio e loop non crea alcuna modificazione.

Quindi ciò suggerisce che il sito di taglio dipende dal lower stem e può esserre influenzato da

eventuali sue modificazioni.

Quindi:

• il terminal loop non influenza il

sito di taglio, anche se eventuali

modificazioni abbassano

l'efficienza del processamento

• è l distanza tdal filamento basale

( in particolare il lower stem ) che

influisce sul sito di taglio

Modello:

• il microprocessore ( Drosha +

DGCR8 ) potrebbe riconoscere la regione a filamento singolo e poi determinare il taglio 11

bp a valle della giunzione tra filamento basale ( a singolo filamento ) e stem ( a doppio

filamento ) . Questo presuppone una molecola capace di riconoscere il passaggio da

filamento da singolo filamento a doppio filamento.

Vanno a cercare quale tra Pasha e Drosha riconoscono la regione tra da ds e ss RNA e quale

due si lega e come sono organizzati.

NB:

• Drosha ha un solo dominio per dsRBD

• DGCR8 fa due domini per dsRBD

Vanno a coesprimere DGCR8 e Drosha marcati con FLAG, rispettivamente al 5' e 3' e poi

vengono immunoprecipitati e copurificati ( a differenza del primo esperimento, qui vengono

marcati entrambi , non solo Drosha che poi fa precipitare con sè DGCR8 ).

Poi vanno a fissare il loro legame al pri-miRNA , attraverso la tecnica UV-crosslinking ( che

impedisce alle due proteine di separarsi dal pri-miRNA ) e vanno a vedere dove si legano.

Mengono messi su un gel di poliacrilammide in cui le proteine vengono separate in base al loro

Peso Molecolare e li

visualizzano su gel di

poliacrilammide servendosi di

coloranti aspecifici ( non

fanno un Western Blot )

Si vede che DGCR8 forma

una sola banda, mentre

Drosha ne forma 3 ( ciò vuol

dire che ci sono 3 versioni di

Drosha, forse formate in

seguito a modificazioni post

traduzionali )

Poi vanno a incubare un pri-miRNA marcato radiattivamente con Drosha e DGCR8 ( marcati

con FLAG, ma serve solo per immunoprecipitarli, non mi danno nessuna visualizzazione

cromatica sul gel ) e fanno l'UV-crosslinking e fanno correre il tutto su gel di poliacrilammide

e vedono una sola banda, corrispondente a dove prima ( nell'altro gel ) era migrato DGCR8.

Ma quello che vedo è la radiattività del pri-miRNA marcato, ciò vuol dire che DGCR8 è

possibile vederlo perchè è legato al pri-miRNA. Invece non ho traccia di Drosha.

Questo vuol dire che a legarsi al pri-miRNA è DGCR8.

Ci si chiede, cosa sia importante nel riconoscimento.

Provano a fare esperimenti di " competizione " ossia oltre a pri-miRNA radiattivo, insieme a

DCGR8, vanno a incubare dei competitori " non marcati " ( siRNA, dsRNA, ssRNA ) che non

sono marcati. Quindi se

osservo una diminuzione

della radiattività, vuol dire

che il DCGR8 si è legato

ad altro e non vedo nulla sul

gel.

Si osserva che il pri-miRNA

è in grado di competere in

modo efficace solo con sè stesso, ma non risente dell'effetto di altre molecole.

Solo un pò l'ssRNA e il dsRNA competono ,leggermente, con il pri-miRNA per legare

DGCR8.

NB: Pre-miRNA= Pri-miRNA senza il segmento basale

Fanno anche dei saggi servendosi di pri-RNA mutati ( sempre per vederne la possibile

competizione ) e vedono che quello processati in modo meno efficiente sono anche quello che

competono meno ( l'efficienza è data dal loop )

Infine provano a fare un saggio , usando un pri-

miRNA artificiale in modo che abbiano sia a destra

che a sinistra il segmento basale.

E si vede come vengano tagliati in due modi

diversi, in quanto DGCR8 non riesce a distinguere

il lato destro da quello sinistro ( in quanto

riconosce la zona di passaggio da single strand a

double, ma qui sono a entrambi i lati ! )

Infine creano sempre i pri-miRNA artificiali con

due segmenti basali e provano in uno a eliminare

un segmento basale ( facendo appaiare i due singoli

filamenti ) oppure li eliminano tutti e due facendoli

appaiare entrambi.

E si ha la conferma di come il tratto singolo

filamento sia essenziale per il processamento.

Quello a tagliare , quindi , è Drosha a circa 11 nt di

distanza tra la giunzione tra segmento basale e stem

( riconosciuta da DGCR8 ). In tutto questo il loop

non ha nessun ruolo, se non regolare l'efficienza.

Il taglio avviene a 11 bp dalla giunzione segmento

basale-stem loop ma non a 11 bp dal loop.

In verità esso può avvenire, ma sembra che il riultato

sia un filamento abortivo che non funziona e viene

subito degradato.

Questo modello , presuppone che Drosha e DCGR8

possano funzionare anche su diversi tipi di RNA non

solo su pri-miRNA.

Grazie a queste nuove conoscenze , ora è possibile:

• invece di usare siRNA perchè sono costosi,

funzionano in modo transiente ( ossia dopo due

generazioni il loro effetto scompare ) perchè nel mammifero manca un sistema di

amplificazione come in C. Elegans

• invece di usare i miRNA di cui mi è difficile conoscere le estremità sfalsate di 2nt

Posso usare un vettore di espressione con cui posso che contenga un promotore come la RNA

polimerasi III, il filamento senso, il loop e filamento anti-senso che mi realizzi un un pri-

miRNA e che poi venga tagliato da Drosha e Dicer così che alla fine ottenga un siRNA di cui

non devo conoscere le estremità perchè me le crea già la cellula .

Si parlerà di shRNA: short harpin RNA ( artificiali )

• sottofamiglia AGO ( prendono il nome dalla specie Arabidopsis )

• sottofamiglia PIWI ( scoperte per la prima volta in Drosophyla )

WAGO

• sottofamiglia ( presente solo nel C. Elegans , ed è coinvolta nella fase di

amplificazione )

Queste sottofamiglie hanno tutte la capacità di interagire con i piccoli RNA.

AGO e PIWI, dal punto di vista evolutivo, sono ben distinte.

Cosa fanno le proteine Argonauta? Legano piccoli RNA guida ( 21-35 nt ) formando un

complesso con diverse funzioni :

1. reprimere la trascrizione del gene

2. promuovere la degradazione di un mRNA ( siRNA )

3. bloccare la traduzione dell' mRNA in proteine ( miRNA )

• Le proteine AGO: legano generalmente miRNA e siRNA ( per lo sviluppo embrionale e il

differenziamento cellulare ) e , solo nelle piante , difendono l'organismo dalle infezioni

virali.

• Le proteine PIWI : legano RNA di 23-30 nt, sono espressi solo nella linea germinale e sono

importanti nella repressione dei trasposoni.

• Le proteine WAGO: è coinvolta nell'amplificazione in C. Elegans

Si fa un esperimento , per vedere quali proteine a che mRNA si associano.

Si prende le cds delle proteine Argonauta e le si mette in un vettore di espressione marcato con

FLA/HA e una volta espressi , queste proteine, vengono isolate usando un anticorpo che lega

FLAG/HA. Così ottengo le proteine espresse nelle cellule transfettate ( cellule HELA ).

Queste proteine successivamente vengono usate in un Nothern Blot per vedere gli mRNA

( 21/16 nt ) che codificano per quelle proteine.

Inserisco un miRNA di 21 nt per vedere se interagiscono con le proteine che ho fatto esprimere

con il vettore : Ago-1, Ago-2 e Ago-4.

Le proteine interagiscono con i piRNA , usati per bloccare i trasposoni.

Le proteine Argonauta, insieme a un RNA guida, va a formare il complesso RISC, che

contiene anche altre proteine che possono conferire nuove funzioni a RISC ( o funzioni

enzimatiche o perchè lo portano in una nuova zona della cellula ) andando così a determinarne

la specificità.

So vede che , contrariamente a quello che si pensava , solo alcune proteine Argonauta sono

endonucleasi.

Il taglio avviene sempre sul legame RNA target tra il nt 10 e 11 dell' RNA guida:

C'e un dominio: MID MC PIWI

N PAZ

• N terminale

• PAZ: contiene un

ologonucleotide-binding-fold

che lega l'estremità 3' dell'

RNA guida

• MID: lega il fosfato 5'-

terminale dell'RNA guida,

allineano l'RNA sulla

superficie di Argonauta

poszionando il legame

fosfodiesterico in prossimità

del sito catalitico. Domini MID diversi di proteine Ago diverse hanno una diversa preferenza

per basi diversi in posizione 1

• PIWI: attività endonucleasica Mg2+ dipendente, attivo solo in pochi membri della famiglia,

ha 3 residui carichi negativamente.

Esperimento per dimostrare il coinvolgimento di altre proteine:

• proteine AGO e RNA non sono sufficienti ad assemblare un complesso RISC funzionante

Si vede che non si riesce a tagliare l' RNA messaggero a meno che non si aggiunga il lisato

cellulare.

Si fa un over-espressione di AGO e si va a fare un'immunoprecipitazione in gel di

poliacrilammide per vedere quali proteine fossero in associazione con Argonauta ( AGO ) e si

vede che si legano molto proteine tra cui hit shock protein. Per conferma bloccano le hit schock

protein e vedono che bloccano anche le RNAi .

• Dicer si associa col dsRNA, poi si dissocia il dsRNA e viene tagliato in frammenti

• Dicer si riassocia con i frammenti ( 21-23 nt ) , in questa fase si associa la proteina TRBP

che si attacca all'estremità 5' più labile ( asimmetria funzionale ) e si legano a Dicer anche

ARGONAUTA e HSP-90. Poi il dsRNA viene inglobato in un complesso dicer + HSP/90

Come avviene il passaggio da Dicer a AGO ?

Le Hit Shock proteine che fanno passare le AGO da una conformazione aperta che lega il

dsRNA a una chiusa in cui resta solo il filamento di RNA con 5' meno stabile e l'altro filamento

( chiamato passegero ) viene degradato.

Come fanno a far degradare l' mRNA e come fanno ad avere una specficità funzionale ?

Il meccanismo fondamentale del complesso RISC è quello di portare l' mRNA con l'RNA dove

poi accade qualcos'altro. I miRNA legati a RISC con i mRNA target sono localizzati nei P-

bodies citoplasmatici in cui avvine la degradazione specifica dell' mRNA.

Quindi non è effetto dovuto , direttamente , all'effetto delle proteine Argonauta.

Modelli di Funzionamento ( riferito ai miRNA )

l'appaiamento perfetto tra l'mRNA e mirRNA avviene solo nella seed region dalla porzione dal

nucleotide 2 a 8 del siRNA, c'è poi una regione di non legame e una porzione in cui c'è solo un

appaiamento parziale.

Quello che fa Argonauta è preporre l' RNA guida a legarsi all' mRNA ( lo prepara in una

struttura, l RNA guida, in una struttura alpha-elica " finta " perchè a singolo filamento).

I processi di associazione RNA con filamento , pre-RISC, richiede ATP.

Come fa la proteina ? la proteina lega lo scheletro fosfodiesterico con la sua sequenza

amminoacidica.

Ci sono due modelli, in cui la estremità 5' è legata al dominio MID:

• two state: il 3' si può trovare in interazione col sito PAZ o con mRNA

• fixed state: il 3' è sempre associato a PAZ

il 3' non contribuisce alla specificità d'appaiamento, tutte le specificità è dato da MID e dai

nucleotidi da 2-8.

Questo vuol dire che questo miRNA può legare mRNA diversi.

le proteine Argonauta possono avere differenti funzioni:

• taglio di long-non coding RNA

• splicing alternativo

• modificazioni della cromatina

• riparazione del DSB

• solo su miRNA e solo su meccanismi post-tracrizionali, però ci possono essere anche effetti

a livello della modificazione della cromatina; è un meccanismo non post-trascrizionale ma

trascrizionale. Oppure il miRNA può modificare il DNA ed è un meccanismo pre-

trascrizionale

La possibilità che il complesso RISC tagli il mRNA in mezzo, accade solo se ci sono proteine

associate con Ago-2 questo avviene solo se c'è un appaiamento quasi del tutto complementare (

come nei siRNA ) ; oppure se l'appaiamento tra miRNA e RNA non è del tutto completo

( mediato da uno qualsiasi degli AGO ) e non si ha quasi mai il taglio dell'mRNA e possiamo

avere la degradazioni o il blocco della traduzione.

Sanno davvero importanti i miRNA?

• si è visto che ci sono patologie nell'uomo legate all'alterazione di specifici miRNA

• la poliadenilazione alternativa, dovuta ad alterazione dei segnali; un singolo gene può avere

trascritti con 3'-UTR diversi. Questo apparentemente non dovrebbe avere effetti perchè non

interesse le sequenze codificanti. Ma invece fa la differenza, perchè questo vanno ( le 3'-

UTR ) a essere punti di attacco dei miRNA. Trascritti più corti, non sono riconosciuti dai

miRNA.

• ad esempio, gli oncogeni , come p53, sono regolati in questo modo! Si hanno trascritti più

corti che non possono essere downregolati dai miRNA

• anche nello sviluppo embrionale, l'allungamento del 3'-UTR è usato per downregolare lo

sviluppo di alcuni geni

Come funziona l'appaiamento miRNA-mRNA?

• una A in porzione 1 e una U in posizione 9, aumentare l'efficienza del processo, anche se

corrisponde a mis match

• poi c'è una regione Bulge in cui non deve esserci appaiamento

• poi c'è una regione di parziale completamento al 3' dove sono importanti i 13-16, ed è

importante per geni miRNA che non si appaiano perfettamente nella seed region

• favoriscono l'appaiamento la vicinanza al codone di stop alla coda di polyA, perchè sono più

accessibili

• solitamente nel 3'-UTR , ci sono siti multipli, se che vicini 10-40 nt, agiscono in modo

cooperativo

• ogni iRNA potrebbe avere centinai di Target di miRNA putativi

• ciascun miRNA regola 100naia di target diversi ?

• ciascun miRNA lo fa o agisce su un target specifico però non ne conoscono le regole di

riconoscimento

• Come faccio a individuare il target del miRNA?

• non si può tentare un doppio micro-array

• una idea sarebbe analizzare il complesso RISC, attraversi una immunoprecipitazione ( con

cross-linking a UV )

Cross linking and immunoprecipitation ( CLIP ) :

• per la precipitazione usiamo anticorpi-antiargonauta

• poi per poter margli gli mRNA ( le cui estremità vengono defosforilate ) si aggiungono degli

specifici linker

• Vedo complessi più piccoli che contengono solo AGO, e complessi più grandi che

contengono anche mRNA che purifico e poi faccio una RT-PCR e amplifico. Poi faccio un

sequenziamento completo di questi cDNA, il che ci permette di discriminare i miRNA da

mRNA. Vedo effettivamente che ciascun miRNA è legato a 100 di messaggeri

diversi.Nonostante il miRNA abbia centinaia di target putativi, posso modularne l'attività,

andando a regolare la quantità del miRNA . Questo sceglierà il target , non in base alla seed

regione che è comune a tutti i target putativi, ma in base alle sequenze accessorie alla seed

regione che ne determinano l'affinità. Inoltre potrei andare a creare una " competizione "

andando a inserire altri mRNA che sequestrino il mio miRNA.

Questo apre le possibilità che ciascun gene target può essere legato da miRNA diversi

( contemporaneamente)

Quindi posso avere sistemi cellulari diversi in cui i miRNA possono legarsi in pochi, in molti o

in moltissimi.

E a questo corrisponderà una diversa quantità di proteine espressa. In questo più miRNA

legano una proteina è espressa:

• casi in cui il miRNA è poco, può abbassare l'espressione può regolare solo l'espressione di

pochi geni, rispetto a quanti ne potrebbe regolare se fosse a una concentrazione maggiore.

Quindi il silenziamento dipende dal repertorio dei miRNA che sono espressi in questo

processo

Esempio particolare: compety eugenous RNA. Possono competere per il sito di legami del

miRNA.

Ci sono lay.once coding RNA che competerebbero con il miRNA

1) MEccanismi di espressione della trasduzione

• come lo studio? non posso semplicemente fare un western blot

Poly-Ribosome-Profiling:

In una provetta creo un gradiente di densità ( con gradiente di saccarosio ) e posso andare a

vedere degli mRNA più leggeri e quelli più pesanti che invece sono i poliribosomi, che

corrispondono a ribosomi associati agli mRNA. In base al numero di poliribosomi associati,

l'mRNA verrà precipitato di più o meno nella provetta.

Per studiare meccanismi di blocco della traduzione, devo studiare direttamente la traduzione,

non la quantità di proteina.

I poliribosomi vengono frazionati su un gradiente di saccarosio.

Più ribosomi sono legati a un mRNA, maggiormente questo mRNA viene tradotto.

Le frazioni che ottengo da questo gradiente di saccarosio le posso analizzare e analizzarne l'

mRNA.

Nel grafico più si va verso destra, piu ribosomi erano associati al Ribosoma. Il

I picchi che si osservano. Dopo l'aggiunta del miRNA posso vedere in che modo si sposta il

picco:

• il picco più va verso sinistra, la traduzione della proteina è ridotta

• il picco più va verso destra, più l'effetto è positivo ( più mRNA viene tradotto ) .

IRES: siti in cui avviene il riconoscimento del mRNA da parte del ribosoma , senza attaccarsi

prima al CAP.

Uno dei meccanismi più importanti nel reprimere la traduzione, sembra essere nella fase di

inizio.

Si trasfettano cellule HELA con mRNA sintetici con siti multipli per miRNA nel 3'-UTR.

La repressione avviene solo dove è presente un CAP al 5'!

Come avviene ciò?

• ci sono proteine che possono interferire con l'interazione eIF4G/eIFG o legano il CAp non

permettendo l'interazione con il ribosoma 40S.

In realtà le proteine Argonauta legano direttamente il CAp, infatti, ad esempio AGO-2, nel

MID-domaain, ha 2 residui di fenilalanina che può legarsi al CAP.

In reaktà dati più recenti confutano questo modello.

Infatti le altre proteine AGO non hanno questo meccanismo ma interagirebbero direttamente

con eIF4E.

Inoltre la proteina GW182 ( proteina in Drosophyla ) è capace di interagire con le proteine

Argonauta , e questo sarebbe un componente fondamentale di RiSC. E' caratterizzata da

ripetizioni di glicina e triptofano che servono per localizzare la proteina nei P-bodies e anche

per il legame ad Argonauta.

Argonauta interagisce con il GW182 , questo distruggerebbe l'interazione tra PABP e IF4G ( il

complesso che fa formare la forma circolare durante la traduzione ).

Meccanismo di GW182:

• la proteina Argonauta

interagisce con la

proteina GW182, che

attraverso due domini

detti miD e carbossil

terminal domani

interagiscono con la

proteina PABP che quindi

non può più interagire

con eIF4G che quindi

impedirebbe il procedere

della traduzione

Quando avviene il blocco della traduzione, i costrutti risultano de-adenilati.

In alcuni esperimenti in cui veniva espressa GW182, e in cui si ha il blocco della tradizione, il

CAP viene deadenilato, e quindi questo potrebbe una parte fondamentale del processo. Quello

che si è visto in cellule senza over espressione GW182 , eliminare la coda di poliA, non

impedisce il blocco delle traduzione. ( ? )

eIF6 serve a porre la subunità 40S sulla subunità 60S ( dei ribosoma ) e questo verrebbe

bloccato dal complesso RISC.

Questo sarebbe dovuto all'interazione del complesso RISC ( in particolare TRBP ) con il

complesso eIF6.

Meccanismi di repressione post-traduzionale:

nel C. Elegans si è visto che lin-14 e lin-28 nonostante la loro traduzione sia bloccata, sonop

comunque associati ai polisomi. Quindi posso bloccare la traduzione, eppure avere dei

polisomi associati, quindi vuol dire che il blocco è avvenuto successivamente all'inizio della

traduzione. QUindi i miRnA possono comunque regolare anche il blocco prematuro della

traduzione anche se è già iniziata . QUindi nono solo pre-traduzionale, ma anche mentre essa è

in corso.

Meccanismi che degradano l' mRNA:

• negli eucarioti la degradazioni dell' mRNA avviene attraverso due meccanismi principali,

che iniziano entrambi con l'eliminazione della coda di poliA. Questo complesso è CCR4-

NOT , che è un complesso multi-proteico.

◦ successivamente l'exosoma fa l'accorciamento da 3' a 5'

◦ dopo una decapping protein ( RCK/p54 ) viene eliminato il CAP e poi al 5' una

esonucleasi EXORN1 fa la degradazione da 5'-3'

◦ le fasi finali della degradazione avvengono nei P-Bodies.

I P-Bodies ricordano molto i corpi cellulari in cui agiscono i piRNA , ma sono diffusi in tutte le

cellule ( e non solo in quelle follicolari ) e sono citoplasmatici ( e non perinucleari )

Il meccanismo ha anche fare con GW182 che può interagire con Argonauta, se lego

artificialmente GW182 a mRNA posso avere la repressione dell'espressione genica senza avere

tutto il complesso RISC e le molecole associate. Ciò vuol dire che tutto questo complesso serve

a portare GW182 sull'mRNA target.

Coerenemte con questa visione, si è visto che se elimino GW182, quasi tutti gli mRNA

aumentano la loro espressione. Ciò vuol dire che GW182 serve a regolare gli mRNA

spegnendo la traduzione o degradandoli . E come fa ? Va a reclutare CCR4-NOT.

Modello: AGo1 recluta GW182 che a sua volta recluta CCR4-NOT che procede alla

deadenilazione.

Questo spiega anche

perchè i siti bersaglio

sono al 3'-UTR , perchè li

vicino c'è la coda di

polyA su cui andrà ad

agire il CCR4-NOT

reclutato da GW182

E' anche vero che gli

stessi complessi RISC

possono bloccare la

traduzione quando essa è già iniziata, ma essa non avviene nei P-Bodies ma nel citoplasma.

Quindi molti degli mRNA vanno incontro a blocco della traduzione o degradazione. In alcuni

avviene solo in blocco della traduzione, in altri anche la degradazione. Il blocco della

traduzione sarebbe più importante, anche perchè esso è reversibile.

In alcuni casi al blocco della traduzione, può seguire anche la degradazione.

I due processi sono comunque interconnessi, dove avvengono entrambi.

Il complesso del GW182 può quindi:

• bloccare associazione subunità maggiore con quella minore

• bloccare l'elongazione, quando la traduzione è gia iniziata

• intergerire con eIF4G e PABP

• reclutare il complesso CCR4-NOT

L'RNA Polimerasi nell'RNAinterference

Le RNA polimerasi RNA dipendenti sono importanti nell'RNAi, soprattutto in C. Elegans ma

anche in altri sistemi modello.

Questo lo si piò capire grazie al fenomeno di RNAi transitiva.

Esperimento: 2 diversi animali transgenici ( C. Elegans ) 1) GFP fusa al 3' di UNC-22

2) GFP fusa al 5' di UNC-22

Tutti i lavori partono dal clonaggio e dalla purificazione di small temporal RNA ( stRNA )

Si comincia a pensare che vi siano moltissimi geni implicati nella formazione degli stRNA.

Il fatto che solo ora inizino a essere scoperti, è dato dal fatto che , le loro ridotte dimensioni,

ne avevano resa difficile l'individuazione " per caso ". Molte volte le sequenze che

codificavano per gli stRNA erano state trascurate , dal momento che i geni non sembravano

trascrivere per delle proteine!

Il lavoro di clonaggio e purificazione deve essere eseguito in modo molto meticoloso, infatti,

è davvero facile incorrere in artefatti.

Dai risultati dei tre team, il 30% dei frammenti clonati e purificati, sembrano avere un

frammento di RNA interessante, dal punto di vista genomico.

Quindi , gli studi descrivono la scoperta complessiva di 100 nuovi RNA , che verranno

chiamati microRNA o miRNA.

Da C. Elegans vengono clonati 5025 inserti, di cui sono trovate 627 sequenze diverse e di

queste, 38, sono trascritti nuovi.

Di queste hanno scartato quelle che non potevano formare strutture stem loop ( simili a

quelle di 70 nt come lem.4 e let-7 ).

Di queste 12% sono conservate in nematodi, insetti e mammiferi e il 90% di C. elegans è

altamente conservato in C. brigsae.

13/38 di queste sono testate su Nothern Blot per vedere se queste vengano espresse o meno ,

e il risulto è positivo.

Si può predirre, mediante analisi informatica, che i miRNA clonati deriverebbero dal

processamento di precursori con strutture secondarie con duplex, loop, e terminazioni 3'

sporgenti.

E' ipotizzabile che tutti questi mRNA siano substrati di Dicer.

Sulla base dei miRNA identificati , sembra che ciascun precursore produca un solo miRNA (

solitamente processato dall'estremità vicina al 3' )

Solo uno dei precursori produce 2 miRNA diversi.

Molti di questi miRNA sarebbero conservati durante l'evoluzione.

Si è visto come il numero di miRNA sarebbe molto più alto rispetto ai siRNA, suggerendo

che essi giochino un ruolo più importante nella regolazione genica.

Alcuni dei miRNA sono organizzati in cluster, suggerendo che possono essere coespressi.

Visto che l'appaiamento tra stRNA così come per i miRNA ha un target molto ridotto, è

assao complesso ritrovare l'mRNA target.

Può darsi che possano regolare i trascritti che abbiano una certa analogia di sequenza, quindi

ciascun miRNA potrebbe regolare un solo mRNA, oppure più miRNA potrebbero regolare

un solo mRNA.

A oggi ci sono:

• 1100 miRNA nell' Homo Sapiens

• 717 mirna in Mus Musculus

• 233 mirn in C. Elegans

NB: i siRNA sono prodotti dal processamento di Dicer oppure in un laboratorio a partire da

nucleotidi ( 19 nt ) con 2 nt sporgenti al 3'. Quelli più lunghi hanno problemi di specificità e

tendenza ad attivare una funzione simil infiammatoria.

Esperimenti , fatti da più gruppi di ricerca, hanno mostrato come alcuni siRNA funzionano

benissimo altri peggio, alcuni sono più specifici altri meno.

Nel percorso della RNAinterference, i siRNA e i miRNA, entrano nel complesso RISC che

serve a guidare gli RNAi sul loro target.

Nello studio, i ricercatori hanno evidenziato come nonostante i siRNA e i miRNA formino iun

duplex, solo uno dei due filamenti viene usato nell'RNAinterference mentre l'altro veniva

degradato.

Si ipotizza, che i siRNA debbano avere le stesse caratteristiche del miRNA:

• devono avere una struttura dsRNA transitoria

• un filamento si stabilizza col RISC, l'altro è degradato

• devono avere la cosiddetta asimmetria funzionale , cioè producono un solo filamento in

grado di essere stabilmente associato al complesso RISC

Per gli esperimenti , come negli articoli precedenti , vengono usati gli estratti di Drosophyla e

il target dell'RNAi è marcato radiattivamente al fosfato al 5', sia senso che antisenso.

Alla fine vanno a misurare la radiattività residua e lo esprimono come percentuale al 100%.

Si va a vedere la

capacità del siRNA

filamento senso 5'-3' e

del filamento anti-senso

3'-5' di fare

RNAinterference.

(B ) Si vede come l'RNA

tagliato dal siRNA

antisenso è

maggiormente degradato

rispetto a quello tagliato

dall siRNA senso.

Come mai , vedo , a

partire da stesse

molecole, un risultato

così diverso? Si può

supporre che sia una caratteristica intrinseca del filamento?

Nel secondo esperimento ( C ) , usando i singoli filamento ( quindi non come duplex ) , sia il

filamento senso che quello antisenso sono degradati. Ma sono degradati, allo stesso modo !

Questo suggerisce che siano uguali, e che quindi la differenza nella degradazione, sono sia una

caratteristica che interessa il modo in cui si appaiano con l'mRNA target.

La differenza, allora , potrebbe essere la capacità che ha uno dei filamenti, rispetto all'altro, di

entrare nel complesso RISC.

Fanno allora , quello che viene definito, un RISC-capture-assay:

• i siRNA sono marcati e inbubati per un'ora estratti proteici di Drosophyla

• si aggiunge un oligonucleotide complementare modificato con un beads magnetico

( funzionamento simile al MACS: magnetic activated cell sorting ) e marcato con il

complesso biotina-streptamidina . Questo oligonucleotide non può essere " attaccato " dal

complesso RISC, ma resta legato ad esso rendendone facile l'identificazione e l'isolamento

del complesso siRNA ( as o ss ) +RISC

Come è possibile vedere ( immagine D ):

• l'antisenso del siRNA è al 22% nel complesso RISC

• il senso del siRNA è a meno dello 0,6% nel complesso RISC

NB:

• colonna vuota: indica il complesso RISC con il filamento siRNA in esso cntenuto

• colonna piena: solo il filamento as o ss del siRNA intrappolato nel RISC, quindi si ha una

purificazione dal complesso RISC

Praticamente ci dice che il filamento che funziona è associato a RISC ( lo si evince dalla

colonna vuota ) e che non è degradato ( si evince dall'altezza della colonna piena )

Come funziona l'asimmetria funzionale?

Vengono notate delle differenze strutturali nel duplex al 5'.

E' il numero di legami H che causa l'asimmetria funzionale? Per verificare ciò fanno una

mutazione , inserendo una U al 5' che si appaia con una G al 3', creando un appaiamento

poco stabile. In questo modo, il filamento senso, prima non funzionante, risulta in gradi di fare

RNAi.

Per completezza viene anche calcolato il per vedere la stabilità delle 4 basi (in posizione

5' ) nel duplex.

Si vede che essendo poco stabile, questo legame G-U, si alterna in due conformazioni diverse.

Da questo si ipotizza che RISC si associa con il filamento il cui 5' ha una maggior propensione

a spaiarsi.

Per saggiare questa ipotesi, si servono di un nuovo gene: sod1.

Si usa un duplex siRNA, le cui estremità sono più o meno simili e di fatti si osserva un

funzionamento più o meno uguale e con una bassa resa.

In seguito, decidono di mutare le vasi, andando ad esempio a sostituire una C con una A e si

vede che si forma un missmatch ( G-A ) e che ora il filamento anti-senso fuziona molto meglio

rispetto al primo.

La cosa sorprendente è che

l'anti-senso funzioni meglio

in seguito a una mutazione

( sostituire C con A ) che

viene fatta sul filamento

senso !

Ciò suggerisce che

l'asimmetria funzionale sia

legata al duplex. Il senso

invece non funziona più, si

ipotizza che sia perchè , in

seguito alla mutazione, non

sia più in grado di appaiarsi

all' mRNA target.

Per vedere ciò, inseriscono

questa volta una mutazione

sul filamento anti-senso, e si

vede che il risultato è

comunque lo stesso. Quindi

il filamento senso non funziona perchè non riesce ad entrare nel complesso RISC, non perchè

la sua sequenza sia stata alterata.

Ciò ci dice anche come non sia fondamentale l'appaiamento del siRNA con l'mRNA target.

• Avere un mismatch al 5' permette al filamento di funzionare in modo esclusivo

• avere un appaiamento debole al 5' permette ancora al filamento di funzionare rispetto

all'altro con apppaiamento G-C

Conclusioni: è la facilità RELATIVA con la quale le stremità 5' di ciascuno dei due filamenti

tende a spaiarsi che discrimina tra quale dei due filamento entrerà nel complesso RISC.

Quale è il limite minimo che permette a RISC di " capire " quale dei due filamenti sia pil più

instabile?

Fanno un altro esperimento ,simile al precedente, in cui vanno a sostituire G con I ( Inosina )

questa può formare sempre legami H, senza avere mai un mismatch.

In base a questo esperimento si capisce che anche solo la differenza di un legame idrogno,

favorisce un filamento rispetto all'altro a entrare nel complesso RISC:

Quando hanno due estremità identiche, non si ha asimmetrie funzionale e entrrambi i filamenti

funzionano quasi allo stesso modo. L'eventuale differenza può essere legata alla capacità

intrinseca dei due filamenti di degradare l'RNAtarget.

In seguito a questi esperimenti si comincia a supporre la presenza di una elicasi-ATP-

dipendente e come lo spaiamento del filamento, ne favorisca il legame al filamento stesso.

Ci si chiede quale sia la elicasi coinvolta: deve essere una elicasi in grado di riconoscere gli

ultimi 3-4 nucleotidi all'estremità 5' e quindi provano a verificare se tutti e 4 i nucleotidi finali

influenzino l' asimmetri funzionale.

Si vede come , andando a variare il nucleotide in posizione 2,3 o 4 , si possa variare il modo in

cui uno dei due filamenti del siRNA venga legato piuttosto che l'altro al complesso RISC.

Mentre non accade nulla se si va a modificare i nucleotidi dalla posizione 5 in poi.

Implicazioni nella biogenesi dei miRNA:

una volta processati, i precursori del miRNA ( 70 nt ) si dovrebbero avere dei duplex simile ai

siRNA.

Si cominciano a trovare non solo i miRNA ma anche i miRNA*, ossia i miRNA 3'-5'

complementari al miRNA ( 5'-3' ). Come mai ?

Evidentemente , anche qui, c'è un processo selettivo che favorisce l'uno rispetto all'altro.

Conceptual dicing:

si va a prevedere quale filamenento

funziona e si vede che nell'appaiamento

con il bersaglio al 5' c'è un mismatch con il

3' del target, favorendo così la " liberazione ""

del miRNA.

Con questa tecnica vanno a studiare diversi miRNA e vedono che 20/27 dei duplex hanno dei

5' più instabili e quindi si ritrova un solo filamento.

Ci sono alcune eccezioni ( come miRNA 20-2 ) che hanno estremità che dovrebbe permettere

a entrambi i filamenti di entrare nel complesso RISC.

Condiserazioni finali:

• l'articolo suggerisce come dovrebbero essere disegnati i siRNA

• i siRNA dovrebbero essere degradati in modo che ci sia solo il filamento anti-senso che entra

nel complesso RisC ( perchè solo quello può appaiarsi all'mRNA in una sitauzione

naturale ), favorendone la specificità. Infatti se entrambi i filamenti del siRNA entrassero nel

complesso RISC, il filamento senso potrebbe andare ad appaiarsi a geni bersaglio diversi.

Modello: AGo1 recluta GW182 che a sua volta recluta CCR4-NOT che procede alla

deadenilazione.

Questo spiega anche

perchè i siti bersaglio

sono al 3'-UTR , perchè li

vicino c'è la coda di

polyA su cui andrà ad

agire il CCR4-NOT

reclutato da GW182

E' anche vero che gli

stessi complessi RISC

possono bloccare la

traduzione quando essa è già iniziata, ma essa non avviene nei P-Bodies ma nel citoplasma.

Quindi molti degli mRNA vanno incontro a blocco della traduzione o degradazione. In alcuni

avviene solo in blocco della traduzione, in altri anche la degradazione. Il blocco della

traduzione sarebbe più importante, anche perchè esso è reversibile.

In alcuni casi al blocco della traduzione, può seguire anche la degradazione.

I due processi sono comunque interconnessi, dove avvengono entrambi.

Il complesso del GW182 può quindi:

• bloccare associazione subunità maggiore con quella minore

• bloccare l'elongazione, quando la traduzione è gia iniziata

• intergerire con eIF4G e PABP

• reclutare il complesso CCR4-NOT

L'RNA Polimerasi nell'RNAinterference

Le RNA polimerasi RNA dipendenti sono importanti nell'RNAi, soprattutto in C. Elegans ma

anche in altri sistemi modello.

Questo lo si piò capire grazie al fenomeno di RNAi transitiva.

Esperimento: 2 diversi animali transgenici ( C. Elegans ) 1) GFP fusa al 3' di UNC-22

2) GFP fusa al 5' di UNC-22

Vedo che il silenziamento avviene solo nel caso del in cui UNC-22 sia posto al 5', perchè quando

si appaia il siRNA per GFP esso agisce in direzione 3'-5' andando quindi anche spegnere il gene

UNC-22, questo non si verifica nel caso in cui esso si trovi al 3'.

Faccio RNAi a questi individui iniettando dsRNA contro GFP nell'ermafrodita e vedo che dai

progenitori wild type verdi ottegno un individuo bianco twitching e l'altro bianco non

twitching.

C'è silenziamento di UNC-22 al 5' di GFP e l'allele endogeno. Dal trasgene con al 3' GFP viene

prodotto un silenziatore capace di silenziare il gene 22, muovendosi in direzione 3'-5', vengono

fatti dei siRNA che hanno come bersaglio delle regioni del mRNA al 5'.

Avevano gia detto che c'è sempre anche un amplificazione del silenziamento emdiato da una

RNA pol RNA dipendente.

Quindi a partire dalle regioni di complementarietà viene prodotto un RNA dall' RNA pol RNA

dipendente.

Queste possono sintetizzare in presenza o assenza di primer. RDE-1 non ha il sito catalitico

di taglio ( ma AGO si )

RISC-dependent requirment of

RDRP

Si ottengono siRNA secondari chimicamente diversi dal primario

Quindi ciò che provoca il silenziamento in C. Elegans sono i siRNA secodnari, non i primari.

Questo spiega anche l'amplificazione del silenziamento.

I secondari sono trifosfati e quindi resistenti al clonaggio, ecco perchè sono stati invisibili

durante il clonaggio.

Articolo 2007: estratti proteici preparati da C. Elegans, dimostrano che RNAdRP è coinvolta, è

presente in un comlpesso già noto RRF-1, e la sintesi dei siRNA secondari è Dicer-

indipendente.

1a- In vivo solo gli animali che sovraesprimono RdRp sono in grado di processare gli RNA

( RRF1 marcato con GFP )

1b-vengono caratterizzati i prodotti con l'utilizzo di RNAsi, i siRNA prodotti da Dicer ( siRNA

primari ) in presenza di RNAsi diventano pù piccoli dopo la digestione, mentre i siRNA

secondari non hanno prodotti di digestione, ciò vuol dire che non hanno estremità sporgenti-.

1c. Determinano la lunghezza dei siRNA secondari ( circa 22 nt )

2. Verificare l'indipendenza da Dicer: i piccoli RNA ( siRNA secondari ) si formano anche in

mutanti di Dicer

3a Verificare la capacità dei siRNA secondari di tagliare l'mRNA ( attività slicer ) , erano stati

visti mono e tri fosfati e senso e anti-senso e vedono che i trifosfati antisenso sono molto

efficienti nell'indurre lo slicing.

3b. concentrazioni crescenti di as 5'-p e as 5'-PPP , quantificando videro che l'attivita dei tri-

fosfati è 10 volte superiore.

Tra le Ago in C. Elegans, CSR-1 è il principale responsabile dello slicer.

Mutanti di CSR-1 non formano piccoli RNA.

siRNA primatio associato a Dicer- RDE-1 recluta RRF-1 - sintesi ex novo di siRNA secondario

- formazione del RISC secondario- silenziamento tramite CSR-1

Quindi il ruolo dei siRNA peimari è il reclutamento di RRF-1 che contiene la RdRP.

Reviex: Transcription And RNAi nella formazione dell'eterocromatina.

Il DNA genomico può essere sotto forma di eucromatina ( trascrizionalmente attiva ) ed

eterocromatina ( trascrizionalmente inattiva ).

In realtà in questa regione, c'è una trascrizione basale necessaria per la formazione e

mantenimento dell'eterocromatina.

Dipende dalla trascrizione.

Eucromatina:

• poco condensata

• istoni iperacetilati

• sequenze uniche

• regioni nei bracci cromosomici

• ricombina in meisosi

• replicata durante la fase S

• ricca di geni

Eterocromatina:

• molto condensata

• istoni ipoacetilati e metilati

• sequenze ripetute

• centromerica/telomerica

• non ricombinazioni in meiosi

• replicata in tarda fase S

• povera di geni

Es eterocromatina: cromosoma X condensato nel sesso femminile e position effect variegation

( PEV ) in Drosophyla, gene white ( colore rosso ) situato in prossimità di una regione

eterocromatica, in seguito a una specifica inversione.

Il gene è trascrivibile ma l'eterocromatina può diffondere fino ad inattivare il gene white

oppure non lo inattiva. Le cellule bianche e rosse restano vicine tra loro.

Utilizzando questo processo si possono individuare i geni che rendono l'occhio rosso con uno

screening genetico.

Sono stati identificati i geni Su ( var ) che sono coinvolti nella formazione dell'eterocromatina.

Il passaggio da Eu a Et richiede una deacetilazione di H3K9 ( da parte di HDAC1 ) , una

metilazione del H3K9 ( da parte di SU ( VAR ) 3-9 ) , a questa H3K9 può legarsi HF1 ( Su-

VAR205) che recluta Su ( Var ) 20 che metila H4K20.

Questo è l'inizio del processo al quale segue la diffusione dell'eterocromatina.

HF1 ha due domini molto importanti:

• cromo domain ( lega H3K9 metilato )

• cromo-shadow domani ( che lega Su ( VAR ) )

HF1 interagisce sia con gli istoni modificati sia con i fattori che la modificano, promuovendone

la diffusione.

Il ruolo di HF1 è conservato dal lievito dino ai mammiferi.

La RdRP, almeno in S. Pombe , ha un ruolo nella formazione dell'eterocromatina come anche

alcuni piccoli RNA.

Gli esperimento che hanno inizio a creare un collegamento tra RNAi ed eterocromatina usano

come sistema modello S. Pombe e dei costrutti centromerici ( con nothern blotting )

Il geen reportere Ura4+ viene inserito nel centromero in posizione cnt, otr e imr.

E' silenziato nel wild type, come dovrebbe essere.

In mutandi di Dicer o di RdRP o di Ago1 il gene non è più silenziato.

Ciò vuol dire che questi geni sono necessari per il silenziamento e la formazione di

eterocromatina.

Vediamo se i DG repeats vengono espressi : no nel wt , si nei mutanti di dicer e ago e RdRP.

ChiP Assay ( vedi appunti Miriam )

RNA pol RNA Dipendente ( RpRD )

Nel C. Elegans si è vista la presenza di RNAi transitiva ( con l'esperimento dei C. Elegans

albini/bianchi sopra detto )

La RpRD sono importanti nella RNAinterferene, servono a generare dei siRNA secondari che

vengono poi processati per formare dei complessi RISC secondari che sarebbero i veri effettori

Chip assay ( Chromatin immunoprecipitation ) si parte da cellule sulle quali in vivo viene fatto Cross-linking-

DNA-proteine ( fatto con formaldeide ). Dopo di che si la lisa là cellule, si estrae la cromatina con proteine

associate. La cromatina viene sonicata e quindi frammentata ( range di 100-500 bp ). La cromatina viene

immunoprecipitata con uno specifico anticorpo, purifico il DNA che era associata alla proteina verso la quale

era diretto l'anticoropo. Con delle proteasi purifico solo il DNA ed ora è possibile analizzarlo ( PCR, qPCR,

microarray : quali sono tutti i geni alle quali è legata la proteina , sequenziamento ).

Chip-on-chip: chi associata a un microarray di DNA Genoimico . Queste tecniche sono state usate per mappare

la posizione di H3K9me e Swi6 ( HP1 ) su DNA. In I, II, III H3K9me è associata all'estero cromatina ( così

come HP1 ) con un picco di arricchimento nella regione centromerica. Chp1, Ago1 e RdRP con

prevalentemente associata alle regioni telomeriche e centromeriche. Ciò vuol dire che una quota di RdRP ( e le

altre ) che si associa al DNA

della RNAinterference.

Quando inizia a formare l' eterocromatina ?

• l'inizio è dato dalla deacetilazione di H3K9, ma quando inizia quest ultimo ?

Studiando S. Pombe si è vista l'importanza di altre proteine, precedentemente associate

all'RNAinterference ( AGo1, Dicer1 e Rdp1 )

Si fa un esperimento con un gene posto nell'eterocromatina e quindi in una condizione

silenziata, ma basta eliminare Dicer1 o Ago1 e vediamo che il gene è espresso ! E ciò ci dice

che l'eterocromatina è stata convertita in eucromatina.

Quindi Dicer e Ago1 sono coinvolti anche nella modificazione della cromatina.

CHIP

Serve a studiare l'interazione tra DNA e proteine ( mediante UV-Cross-linking e successiva

immunoprecipitazione ),e si vede che AGO1 è Chp1 ( omologo di HP1 ) sono localizzati negli

immunoprecipitati contenenti l'eterocromatina!

Quello che si vede :

• formazione e mantenimento dell'eterocromatina richiede vari geni tra cui :

◦ RITS ( analogo a RISC ) fatto da AGO1+ChP1+Tas3 e siRNA derivati da dg e di

◦ RNA-directed-RNApolymerase-complex

◦ Importante anche il ruolo di Dicer

• modello self-reforming loop:

◦ Si associano i fattori dellla cromatina ( ad esempio Clr4 ), poi si legano il complesso

RITS e RDRC. RITS contiene Chp1 che riesce a riconoscere la lisina metilata

Vengono prodotti nuovi siRNA secondari che reclutano altri complessi RITS che reclutano

Clr4 metilando la lisina 9 dell'Istone H3.

Il reclutamento avviene sull'mRNA ma si agisce sul DNA!

Tethering RITS

Ci si chiede se il complesso RITS sia da solo sufficiente a formare l'eterocromatina.

Si usa una trasgene per studiare l'eterocromatina.

Usano la proteina di auto terminazione del fango lambda , detta pN che serve a regolare la

durata della trascrizione , è in grado da una parte a legare l'mRNA ( interagendo con dei siti

detti B-Box ) e dall'altra a legare le proteine del complesso RITS ( le fanno legare una a una

per testarne gli effetti separatamente ).

Usano per lo studio il gene URA4+ il quale se è espresso e sul terreno di coltura c'è il 5-FOA la

cellula muore, quindi si usa questo metodo per selezionare le cellule vive e quindi in cui

URA4+ è spento .

Prendono le cellule di S. Pombe con una concentrazione a scendere. Fanno dei terreni, uno

normale e uno con FOA. E vedremo le cellule in cui URA+ è stato spento.

Nell'esperimento si ha :

• wt: il quale muore su terreno con FOA

• Controllo in cui l'URA4+ si trova già nell'eterocromatina e quindi la cellula non muore

• Controllo in cui là proteine di auto terminazione del fango lambda è legata a GFP: è una

proteina che non c'entra nulla e la cellula muore

• auto terminazione del fango lambda + Tas3: la cellula questa volta sopravvive e quindi

l'eucromatina è stata trasformata in eterocromatina, e aTas3 da solo è sufficiente ( gli altri

provati non hanno questo effetto ) e questa modificazione è stabile nel tempo

Poi vogliono vedere se tas3 ha lo stesso effetto senza la proteina lambda presente, e si vede che

non è così ! Questo perchè tas3 non riesce a rimanere incatenato all'mRNA e a mantenere il suo

effetto sull'DNA.

Per conferma fanno un nothern Blot per vedere se URA4+ è davvero silenziato.

Ma questo silenziamento è trascrizionale ( agisco sul sito DNA ) o post-trascrizionale ?

Vanno a vedere se le caratteristiche della cromatina sono sempre le stesse e ciò viene fatto

attraverso l'immunoprecipitazione ( Chip ) a cui segue una PCR ( in cui i primer che

amplificano le sequenze contente la regione del trasgene contengono degli oligonucleotidi

radiattivi , per facilitare la visione anche di breve sequenze )

PCR dopo immunoprecipitazione: URA4+ ( sarebbe la regione trasgenica 9 e usa come

controllo ACT+ un gene non eterocromatinico.

La maggiore radiattività è data dal fatto che c'è più URA4+ precipitato con H3-K9 ( marker

cromatico ).

La radiattività viene aggiunta grazie a nucleotidi contenuti nei primer usati per la PCR

semiquantitiva.

La modifica è quindi trascrizionale : si è modificato il DNA.

Si legge sull'esperimento input ( è il materiale di partenza della cromatina ) serve a far vedere

che è stata usata sempre la stessa quantità di cromatina.

L'esperimento di CHip serve a dire di quanto un precipitato si arricchisce di una precisa

sequenza.

Fanno un'altra CHIP per Chp1 e viene fatta seguire a PCR che amplifica una per una le regioni

1 a 6 ( dove 1 è la regione più vicina alla BBOX e la 6 quella più lontana ) e vedono che la

radiattività arriva fino alla regione 2. QUindi si ha anche una diffusione della cromatina.

Si vede che questo processo richiede DICER!

Inoltre si vede che Chp1 per legarsi al DNA richiede che ci sia la trascrizione e lo stesso vale

per Tas 3, perchè è l'mRNA che fa da guida.

Poi si vede che anche tutte le proteine della RNAi ( come Dicer ) sono necessarie per

mantenere il silenziamento indotto da TAs3

Si vede come anche Dicer-1 sia importante e questo suggerisce che i siRNA prodotti da DICER siano

importanti!

Se il complesso RITS è portato sull'mRNA in modo artificiale attraverso la proteina di antiterminaziome ,

perchè ancora importante Dicer ? Visto che il suo unico ruolo è quello di fare dei siRNA che guidano Tas3

sull'mRNA; ma noi lo abbiamo già fatto artificialmente attraverso la proteina di anti-terminazione.

Quindi con nothern Blot, vado a vedere che si formano dei siRNA URA4+ solo quando è presente tas3-legato

alla proteina di antiterminazione. E sono definiti dei siRNA secondari, ma non come quelli che vedo in C.

Elegans, ma perchè derivati dal processo dell'mRNA di URA4+. Per vedere quali proteine sono associate a

tas3, si fa un esperimento detto Chip-TAp ( Chip in Tandem ). In cui si fanno precipitare non solo la proteina di

interessa, ma tutte quelle associate a quest'ultima.

E si vede che copurificando il complesso RITS usando ChP1 si ha anche co purificazione per i siRNA di

URA4+.

Vogliono vedere anche se togleindo proteine del complesso RITS, come fatto prima per vedere se erano

coinvolte o meno nella formazione della eterocromatina, c'è anche un'alterazione nella formazione dei siRNA.

Ed infatti è così.

Quindi nel silenziamento operato da Tas3 si formano nuovi siRNA complementari a URA4+ e i componenti

rischiasti per la loro formazione sono gli stessi necessari anche per la formazione dei siRNA centromerici.

Nell'RNA transitiva si vede che viene spento, quando si fa il transgene, anche il gene endogeno ( come visto

Nell'esperimento del transgene del C. Elegans GFP-UNC22 ) ; quindi se i siRNA secondari silenziano il

transgene di ura4+ dovrebbe spegnere anche il secondo allele posto su un altro cromosoma.

Fanno quindi un transgene per ura4+ con boxB e uno senza boxB ma con un introne in modo che il trascritto

sia più lungo e distinguibile da quello col boxB.

Fanno di nuovo il test usando come selezione un terreno contenente FOA e vedono che le cellule contenente il

secondo alle di ura4+ muoiono, questo perchè il secondo allele è espresso.

il siRNA dunque non agisce in TRANS?

Fanno nuovamente là CHIP per andare ad analizzare la cromatina e si vede che il secondo allele non presenta

eterocromatina.

Perchè non agisce in trans?

Potrebbe essere dovuto a una esoribonucleasi capace di degradare i siRNA ( eri1 ) che degrada i siRNA quando

si trovano nella forma dsRNA. Cosa vedo dunque se elimino eri1?

Si vede come come in assenza di eri1 c'è un minimo gradi di silenziamento, ma è un avvenimento molto raro.

Per confermare ciò vanno a vedere nuovamente la cromatina, anche in assenza di eri1 e si vede questa volta

che l'eterocromatina è presente anche per l'allele in trans.

Quindi sarebbe un silenziamento genetico trascrizionale dipendente dalla cromatina ( TGS ).

Come vede con quanta efficienza la RNApolII si lega al promotore? Vado a usare di nuovo là chip, uso un

anticorpo per una delle sub dell'RNA polII. Fanno là Chip per regioni da 3 a 6 ( come l'esperimento precedente

per vedere l'espansione della cromatina ). Se è presente o assente, l'RNApol II si lega comunque al DNA.

Questo dunque vuol dire che la RNApol II si lega al DNA indipendentemente che ci sia eterocromatina o

eucromatina.

Vogliono fare un controllo negativo, ossia vanno a eliminare il promotore ( in questa situazione dunque la

RNApolII non dovrebbe essere legata ). Qui si vede, come ci si aspettava, che la cellula vive e quindi l'URA4+

non avendo promotore non è stato legato dalla RNApoll e quindi non è stato trascritto è espresso. Con una

Chip si conferma come la RNApolII non sia più associata.

Quindi è un processo post-inizio trascrizione ( perchè in ogni caso la RNApoll, quando c'è il promotore, che ci

sia o meno eucromatina, si lega ). Vanno a vedere come si comportano altri promotori, andando a studiare in

particolare le regioni centromeriche ricche di ripetizioni dG e dH.

• si fa un costrutto con seq. Ura4+ dentro una seq centromerica. E si fa un gel con un wild type, con un

mutante per Dicer e uno per clr4 ( responsabile della formazione di eterocromatina ) e vedono come

l'uRA4+ contenente i mutanti sia espresso ( pur trovandosi in una regione eterocromatinica ) per controllo

vedono l'espressione di un gene fuori dalla regione eterocromatica e vedono come sia espresso anche nel

wild type. Vanno a trovare conferma con una Chip per la RNApolII e vedono come essa sia associata.

• Poi vedono l'associazione nelle regioni dG e nel wild type la RNApolII non si lega mentre se manca Dicer e

clR4 si, diversamente da quello che si vede nel caso di dH.

Discussion 1:

• la formazione dei siRNA secondari e il loro caricamento in RITS richiede: Dicer, Rdp1, Cid12, H221 e Clr4,

anche se l'associazione dipende da Dicer e Clr4, quindi l'associazione di RITS e RDRP sul trascritto

nascente potrebbe essere accoppiata alla sintesi di dsRNA da parte di RdP1. Questo dsRNA potrebbe essere

processato da Dicer in siRNA secondari. Questi siRNA potrebbero partecipare ad aumentare il silenziamento

tramite RNAi dei trascritti.

• Il meccanismo di silenziamento funzionerebbe anche in TRAn ma in maniera molto ineguale

• A livello fisiologico, l'interazione tra complesso RITS e DNA avverrebbe per interazione tra mRNA e siRNA

primario.

• Il trascritto di regioni dG e dH è riconosciuto da siRNA primario che servirebbero a reclutare il complesso

RITS

Analizzando le gonadi di Drosophyla si sono visti piccoli RNA non classificabili nè come

siRNA nè come miRNA; erano più lunghi dei miRNA ( 23-29 nt ), non avevano precursori a

forcina nè target che codificavano per una proteina precedentemente nota.

Inoltre il loro processamento non richiedeva Dicer. Infine, sono sempre associati a proteine

della sottofamiglia Piwi-like.

Questi piRNA sono specifici per le gonadi ( non si trovano in altri loci cellulari ) ; sono attivi

prevalentemente durante la meiosi della linea germinale e avrebbero la funzione di silenziare

gli elementi trasponibili ( per evitare che si siano alterazioni dell'espressioni di geni codificanti

per proteine ).

Per questo nelle cellule germinali ci sono numerosi meccanismi che svolgono funzioni

analoghe.

I piRNA funzionano sugli elementi trasponibili che hanno un intermedio a RNA.

Alcune note di riepilogo riguardo ai trasposoni:

• Trasposoni a DNA che ssi muovono con meccanismo " taglia e incolla ". Hanno un

intermedio a RNA che formano trasposoni nel citoplasma che poi tornano nel nucleo e si

legano a estremità ripetute nel DNA e excide il DNA del trasposone che può reinserirsi in un

altro punto del genoma. Per cui un piRNA, bloccando l'RNA delle traposasi , bloccherebbe

l'excissione

• Trasposoni con LTR, che prevede vari intermedi a RNA. Codificano per due proteine GAG e

Integrasi, che formano particelle pseudovirali ( circondate anche da un capside ) e questo

complesso entra nel nucleo e una volta retrotrascritto può integrarsi. I piRNA posono bloccar

e GAG e Integrasi oppure bloccare l'intermedio a RNA che ritorna nel nucleo.

I piRNA si associano a Piwi formando un complesso piRISC e impedendo la mobilità dei

trasposoni. Anche il loro 3', come nei siRNA, è metilato a livello del 2'-O H ( a opera della

proteina HEN-1 )

HEN-1 riconosce il Ribosio perchè ha un gruppo ossidrilico vicino a un altro gruppo

ossidrilico ( mentre in tutti gli altri il gruppo ossidrilico è vicino a quello fosfato )

Viene usato l ' S-adenosil-metionina da parte di HEN-1 per donare CH3.

Proteine piwi-like in Drosophyla:

• PIWI

• AGO3

• AUB Sia in Drosophila che nel Topo le proteine

Proteine piwi-like nel Topo: Piwi-Like sono importanti per la fertilità,

• MIWI AGO3 in particolare nelle femmine.

• MILI

• MIWI2

Proteine piwi-like nell' UOMO:

• PIWIl1,2,3,4

Se eliminiamo PIWI,AGO3 e AUB, vediamo più eventi di trasposizione ( confermando il ruolo

delle tre proteine )

Anche nei mammiferi si osserva lo stesso; se inibisco MIWI,MILI si ha un attivazione di LINE

e LTR e un arresto della gametogenesi e la sterilità maschile.

1. i piRNA agiscono con un meccanismo post-trascrizionale, funzionano solo quelli anti-

senso

2. possono bloccare la trasposizione andando a metilare le CpG-Island ( localizzate vicino ai

promotori )

3. possono andare a causare una modificazione della cromatina

i piRNA possono avere , come target-eccezione , mRNA che codificano per proteine. Ad

esempio nelle cellule follicolari dell'ovaio, poche cellule non germinali che contengono

piRNA. C'è una Fas3 il cui mRNA viene bloccato a causa dei piRNA.

Come avviene?

Si parte da un gene detto Tj, il cui trascritto da una parte ( la regione ORF ) fa un fattore di

trascrizione detto Tj che va a far trascriver piwi, mentre il 3'-UTR, sempre del gene Tj, origina

il piRNA vero e proprio che assieme a piwi formerà il complesso piRISC.

i piRNA possono essere coinvolti nel silenziamento di Nanos. Il piRNA roo e 412 associati ad

AUB e AGO3, che reclutano un complesso sul 3'-UTR di Nanos bloccandone la trascrizione!

Da dove arrivano i piRNA?

Da due processi principali:

• processamento primario

• ping-pong amplification loop

Alcuni piRNA derivano solo dal 1, i piRNA creati in questo modo hanno un funzionamento

generico ( vengono sintetizzati tutti i piRNA possibili ); poi tra questi , il meccanismo ping-

pong, amplifica solo quelli con funzioni specifiche.

Il processamento primario avviene sempre.

Si è visto che tutti i piRNA iniziano con una U, si parla di 1U-bias.

Le sequenze di derivazione dei piRNA, sono localizzate in poche regioni concentrate di 200kb,

dette piRNA cluster. Ma le sequenze dei piRNA non sono in fase all'interno del cluster come i

siRNA, non c'è una struttura a forcina.

In alcuni cluster i piRNA si appaiano su entrambi i filamenti, suggerendo che quelle regioni

siano trascritte in entrambe le direzioni.

IPOTESI: i precursori dei pIRNA sono lunghe molecole a filamento singolo ( ecco perchè

DIcer non funziona, infatti agisce solo su i dsRNA). I precursori sono stati individuati tramite

RT-PCR.

Inoltre, la distribuzione del 5' del locus, impredisce la formazione dell'intero locus ( controlla

su slides/sbobinature)

Sarebbero coinvolte delle proteine , tra le quali:

• Zucchini ( ZNC ) è una pitativa nucleasi

• Armitage ( ARM ) è una proteina RNA elicasi

• Female stule 1 ( YB ) è un Tudor Domain ( vedi slides / sbobinature )

Come si fa, all'interno del Cluster dei piRNA, a scegliere quelli specifici per quei trasposoni ?

In Drosogila il piRNA cluster viene chiamato Flam locus e contiene delle sequenze di

appaiamento per 3 trasposoni : IDEFIX, Cypi e ZAM.

Come fanno le sequenze dei cluster a essere constantemente aggiornate?

In Drosofila ci sono piRNA cluster che sono in posizione conservata, ma le sequenze contenute

in esse sono diverse, a seconda dei trasposoni a cui sono andati incontro.

Come può avvenire ciò?

• in modo casuale, integrazione casuale dei nuovo trasposoni nel pIRNA cluster

• meccanismi specifici per infilare i trasposoni nel piRNA cluster

Amplificazione PING-PONG

Piwi e AUB sono principalmente associati a piRNA antisenso e iniziano con una U . Mentre i

piRNA associati a AGO3 son senso e possiedono A in posizione 10.

Inoltre sono complementari ai primi 10nt dei piRNA antisenso.

AUB porta un piRNA antisenso con 1U al 5', ed è stabilizzato con un taglio e una metilazione

al 3'-OH e possono appaiarsi ai trascritti del trasposone in modo perfetto. Questo appaiamento

è possibile solo se il trasposone è attivo. Sul filamento senso c'è un taglio a 10 nt

dall'appaiamento con la U dell'anti-senso, il filamento avrà quindi un nuovo 5' e una A in

posizione 3' ( appaiamento A-U del piRNA ) ed è il substrato di AGO3 e viene tagliato anche al

3' e viene metilato a livello del 2'-OH da HEN1. Si forma un complesso priRISC contenente il

filamento senso del Trasposone, ora questo si può appaiare al lungo filamento del piRNA

cluster, formando un piRNA antisenso specifico per il trasposone da cui si è partito , si crea

così un piRNA secondario.

I piRNA primari sono universali , mentre quelli secondari si amplificano solo per quel

determinato trasposone.

In questo modo sono eliminati solo i trasposoni che sono attivi.

Lo stesso vale per i mammiferi , con delle differenze:

• il piRNA primario è senso ( associato a MILI ), mentre quelli secondari sono anti-senso

( associati a MIWI-2 )

• c'è una diversa localizzazione subcellualre ( Pip-body e pi-body )

Il ruolo del ping-pong cycle è ottimizzare la popolazione dei piRNA sulla base dell'effettiva

presenza dei trascritti dei trasposoni.

Come si spiega la funzione dei piRNA ripartita in Pip-body e pibody?

Una possibile spiegazione si può avere dal fatto che le proteine AGO e AUB possono avere

arginine che vengono metilate e possono interegatire , in seguito a ciò, con proteine con un

dominio ( o più di uno ) di integrazione per gruppi metilici, ad esempio le proteine TUDOR,

che avendo siti di interazioni multiple, possono formare complessi molecolari estesi a zone

della cellula. Ad esempioil complesso con proteine Piwi diverse che possono favorire

l'interazione del piRNA con la proteina AUB , prima , e con la AUB , poi.

Le TUDOR hanno siti di interazione mltiple con complessi metilici e quindi possono legare

due proteine piwi-like metilate ( AGO-3 e AUB ) favorendo lo scambio ping-pong like.

Perchè ciò che questo possa avvenire, tutte le proteine e i piRNA devono essere colocalizzate.

E si vede che è cpsì, localizzati in citoplasmatici poco aldifuori del nucleo.

In questi granuli avverrebbe il riconoscimento e il processamento dei precursori dei piRNA,

che vengono trasportati dal nucleo al citoplasma dopo la trascrizione.

La proteina AUB è localizzata in strutture perinucleari prive di membrana dette " nuage

" ( dove si accumulano le proteine PIWI-like ).

Nelle cellule follicolari si trovano strutture citoplasmatiche dette Yb-bodies.

Nel nuage avrebbe luogo la trascrizione del piRNA e si avrebbe tutto il processo

precedentemente detto per formare il piRNA primario. PIWI è una proteina nucleare, ma poi si

sposta nel citoplasma a livello della nuage.

Invece i Yb-bodies non sono perinucleari, ma corpi staccati.

Nei mammiferi , il ping-pong, avviene tra due gruppi di granuli diversi pPi-body in cui è

localizzata MIWI2 e pi-body ( MILI )

NB. Female Sterile YB-Tudor Protein espressa

Nelle cellule follicolari: Yp-bodies contengono la proteina Yb necessaria al processamento

primario


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9 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia molecolare e cellulare
SSD:
Università: Bologna - Unibo
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher antoniocarusillo93 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia molecolare degli eucarioti e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Bologna - Unibo o del prof Ambrosetti Davide Carlo.

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