RNAi Interference

Introduzione al RNAi usando come modello C. Elegans

C. Elegans - Introduzione

• Facile da allevare
• Ciclo di riproduzione rapido
• È un sistema semplice ma complesso, perché pur avendo meno di 1000 geni è comunque completo
• Si nutre di E. Coli
• Il suo ciclo vitale dura 3 giorni, a temperatura ottimale di 25°C
• La sua trasparenza permette l'osservazione in vivo delle varie fasi del suo sviluppo (si possono usare anche geni reporter con coloranti come GFP - green fluorescent protein)
• È invariante, il numero di cellule e la sua forma sono estremamente costanti tra individui e ne permettono la descrizione dettagliata
• È stato uno strumento fondamentale per lo studio della RNA interference

Ciclo vitale - breve

• Deposizione uova (max 300 - il numero varia con la temperatura)
• 4 stadi larvali (durata di circa 2 giorni)
• La larva può essere maschio o ermafrodita
• L'uovo fecondato resta 40 minuti nell'utero e poi è deposto all'esterno
• In caso di sovraffolamento della piastra o temperatura eccessiva, si ha un ciclo alternativo, si genera un permanente. Ossia lo sviluppo non procede fino allo stadio adulto finché non ci sono condizioni migliori
• Le uova di C. Elegans possono essere congelate come i batteri

Alae

Sono strutture, simili a binari, che percorrono tutto il corpo nella parte centrale. Sono formate da cellule dette SEEM CELLS. Queste ultime, possono essere usate come controllo per difetti dello sviluppo durante lo stadio larvale.

RNA - Come si fa?

Non posso servirmi di una RNAPolimerasi eucariotica, in quanto è costituita da un grande complesso proteico, che necessita per il suo funzionamento, di un altrettanto variegato insieme di fattori di trascrizione. Quello che si può fare, per facilitare il processo, è servirsi di una polimerasi batterica. In particolare mi servo di batteriofagi, che possiedono le polimerasi affini per SP6, T7 e T3.

Mi vado a servire dunque di batteriofagi con siti di clonaggio multipli (MCS) in cui vado a inserire il gene di interesse e lo faccio trascrivere. Prima di inserire la polimerasi, è consigliabile linearizzare (usando enzimi di restrizione) il genoma fagico.

Oppure, un metodo più veloce, potrei usare la PCR e mi disegno i primers forward e reverse per il mio cDNA, inserendo così il promotore (contenuto nei primer).

Primi studi e osservazioni sull'RNA interference

The white petunias

Il colore scuro, raro, è dovuto a un gene detto calcone sintetasi. Nel tentativo di creare una petunia completamente scura, venne fuori un fiore completamente bianco, come se il gene non fosse più espresso! Tale fenomeno venne detto co-soppressione, in quanto un trans-gene inibisce l'espressione del gene endogeno. Come funziona? Dieci anni dopo venne scoperto.

Per vedere la funzione del gene, vado a modularne l'espressione. In particolare vado a vedere cosa succede se inattivo del tutto il gene: knock-out genico. Se volessi invece diminuire la quantità di una proteina?

Vecchio metodo: (Premessa: l'mRNA 5'-3' è detto senso, quello 3'-5' è detto anti-senso) Si vuole usare un RNA antisenso (sintetizzandolo artificialmente per poi iniettarlo) oppure trascrivendo un DNA, quello che devo usare non è il 3'-5' (come stampo per l'RNA) ma il 5'-3' ottenendo così un RNA 3'-5', quindi anti-senso. Questo sarà complementare all'RNA endogeno e andrà a ridurre la quantità di proteina.

Ma come funziona? Questo fu lo studio con cui Craig Mello e Fire, tentarono di rispondere, esaminando il C. Elegans.

Prima teoria: filamento senso e anti-senso che si combinano

• Funziona sia l'RNA senso che antisenso
• L'interferenza si trasmette alla progenie

Nuova ipotesi

Sia nell'RNA senso che in quello anti-senso, ci sarebbero altre molecole coinvolte. Nella preparazione dell'RNA, osservo che si ottiene dell' "altro materiale", si trattava di RNA a doppio filamento, dsRNA. L'RNA polimerasi può sintetizzare altro RNA, usando l'RNA stesso come stampo! Si vennero a creare così molecole parziali di dsRNA.

Nello studio di Mello e Fire vennero presi in esame i geni UNC. Geni UNC (uncordinated) sono una famiglia di geni che, quando mutati, mostrano un fenotipo non-coordinato. Quindi vanno a interessare sia muscoli che nervi. Alcuni geni mostrano un fenotipo non-coordinato andando a mutare anche i geni della cuticola (un esempio sono i Roll-mutans, mutanti di C. Elegans che possono strisciare unicamente in circolo).

Viene scelto in particolare il gene UNC-22:

• È abbondante, come mRNA
• Non è essenziale per la sopravvivenza
• C'è una correlazione semi-quantitativa tra riduzione dell'espressione del gene e fenotipo

Mello prende l'RNA senso (ss) e anti-senso (as) e lo purifica ulteriormente. Contemporaneamente prepara anche un dsRNA. Quindi testa, separatamente, as, ss e dsRNA. I primi due C. Elegans trattati con ss e as non mostrano il fenotipo twitching, proprio di quello mutato, mentre il C. Elegans trattato con dsRNA mostra immediatamente il fenotipo alterato. Lo stesso effetto si ottiene anche iniettando ss e as, nello stesso organismo, separatamente ma con un intervallo minore di un'ora.

Gli effetti del fenotipo alterato sono uguali a quelli che si avrebbero se si andasse a "spegnere" il gene con una tecnica di knock-out.

Cosa si riscontra, dunque?

• Se si mette fuori gioco (knock-out) UNC-22 si ha lo stesso fenotipo osservato dopo l'iniezione di dsRNA
• Se si vanno a iniettare dsRNA con target i geni fem-1 e hcl.-1 si ha la comparsa di un fenotipo alterato, uguale a quello che si avrebbe spegnendo gli stessi geni
• In alcuni organismi, l'iniezione di dsRNA innescava l'attivazione della PKC, una proteina con un effetto anti-infiammatorio. Ma non è questo il caso, in quanto con geni diversi, otteniamo un fenotipo alterato specifico per ciascuno dei geni (non si ha un fenotipo alterato comune che potrebbe essere confuso per un qualche tipo di effetto anti-infiammatorio).

Un'eccezione sembra essere il gene UNC54C, che provoca un fenotipo in cui l'embrione e la larva sono del tutto bloccati (non si osserva un fenotipo un-cordinated, c'è un blocco totale).

Come si spiega?

UNC-54C copre (il tratto di mRNA) circa 3 esoni, e quindi, il dsRNA, che ha come bersaglio UNC54C, colpirebbe tutti i geni con una sequenza parzialmente conservata! Quindi sarebbe un'eccezione alla "specificità" dell'RNA interference. Tutte le regioni corrispondenti a introni e promotori, non producono RNA interferenti, questo potrebbe significare che la RNA interference avviene a livello post-trascrizionale, ossia dopo che sono stati eliminati gli introni.

Per avere il fenotipo un-cordinated

Per avere il fenotipo un-cordinated, significa che l'RNAi deve agire su molte cellule. Per dimostrare ciò, vengono usati due C. elegans transgenici, dove solo nelle cellule muscolari ci sono delle marcature (GFP nei mitocondri e GFP-lacZ nei nuclei). Se inietto un dsRNA per UNC-22A, la GFP viene comunque espressa, ma il fenotipo è twitching, ciò vuol dire che l'azione del dsRNA è altamente specifica (inattiva UNC22A ma lascia inalterato il gene reporter per la GFP ! ). Infatti se metto un dsRNA per il gene reporter della GFP, non vedrò più la colorazione.

Vediamo cosa succede all'mRNA

Facciamo un'ibridazione in situ, si sceglie un gene detto Mex3. Uso una sonda radiattiva che fissa l'mRNA per questo gene. Se aggiungo l'asRNA la quantità di RNA diminuisce, ma non scompare! Usando, invece, il dsRNA non vedo più la colorazione: l'RNA per il Mex3 è stato completamente degradato. Infine provano altri siti di iniezione (gonade, testa e coda) e vedono che indipendentemente dal sito, ho interferenza a RNA. L'effetto di espressione, quindi, non dipende dal punto di iniezione! Deve esistere un complesso sistema di trasporto per l'RNA.

Deduzioni

• Essendo un meccanismo specifico, permette di studiare e comprendere meglio la genetica in C. Elegans
• A. Limiti: se il gene è membro di una famiglia e ci sono porzioni conservate, vengono inattivati più geni contemporaneamente
• B. Ci sono RNA più resistenti di altri, che subiscono in minor modo o per niente l'effetto dell'RNA interference
• Tale scoperta può essere comunque estesa ad altri modelli animali. Tali modelli funzionano tutti, ma con differenze
• L'uso di RNA interference permette di fare delle genetica-inversa, ossia di andare a vedere che cosa succede al fenotipo se vado a variare (in questo caso a modulare) un gene, invece di usare il metodo del knock-out, molto più dispendioso e laborioso.
• Inoltre, in C. Elegans, è possibile iniettare l'dsRNA facendolo esprimere ai batteri di cui esso si inutre o immergendolo in una soluzione contenente anche dsRNA.

Si ipotizza la presenza di un meccanismo di amplificazione dell'RNA, in quanto si è visto che è possibile ottenere l'alterazione del fenotipo anche iniettando una piccolissima quantità di dsRNA. Inoltre, il fatto che il punto di iniezione del dsRNA non sortisca effetti sul fenotipo osservato, fa pensare alla presenza di un complesso e ancor ignoto sistema di trasporto dell'dsRNA stesso.

Esperimenti presi in esame

Si vede come l'RNA interference si verifichi solo quando si va ad aggiungere sia il filamento senso che quello anti-senso (unc22). Fa eccezione il gene unc-54 dove l'interference provoca una completa paralisi e non il fenotipo Uncordinated.

Si hanno tre C. Elegans che sono stati marcati e resi visibili con la GFP. Nel controllo si va a iniettarli con il ds-RNA per unc-22 e si vede che la GFP è ancora espressa. Questo conferma la specificità del RNAi. Nella seconda figura, invece, si fa una iniezione specifica per la GFP e si vede come tutta la GFP, a parte due cellule, venga spenta. Nell'ultima, invece si fa una iniezione anti-lac-Z che era stata precedentemente marcata con la GFP ed anche questa volta non si osserva la reazione luminosa.

Si vuole andare a vedere cosa accade all'mRNA

• a: Nel controllo l'mRNA non viene marcato (è come se non ci fosse)
• b: L'mRNA viene marcato e si vede tutto nero
• c: Viene fatta una iniezione solo con as-mRNA e si vede un leggero schiarimento (confermando il coinvolgimento del filamento anti-senso nell' RNA interference)
• d: Viene fatta una iniezione con il ds-RNA e si ha una completa degradazione dell' mRNA!

Articoli due anni successivi a quelli di Fire e Mello

Viene usato un nuovo modello sperimentale per poter capire meglio cosa sia l'RNAi. Dunque viene adottato un sistema in vitro, perché quando è in vivo, non si può capire bene la funzionalità dell'RNA, capire quali geni sono coinvolti. Studiando le piante si è visto come le funzioni dell'RNA sarebbero stabilizzare il genoma (bloccando la funzione biologica dei trasposi nelle piante), ma anche come difesa dai retrovirus. E l'RNA creerebbe frammenti di 25 nt anche nelle piante.

Ci sono dei geni rde (RNAi defective) che se mutano manca l'RNAi. Mello trova anche geni come ego-1, che è una RNA-polimerasi-RNA-dipendente e si ipotizza che sia coinvolta nell'amplificazione dell'RNA.

Per l'esame in vitro vengono usati estratti di embrione di Drosophila. Vengono usati anche due geni reporter Rr-Luciferasi e Pp-Luciferasi, stabilizzati con un CAP al 5' e la coda di poly(A) al 3'. Pre incubando il dsRNA con il lisato, il fenomeno è più veloce. Quindi qualcosa contenuto nel lisato, amplifica l'efficacia del dsRNA.

L'RNA viene marcato completamente o solo al 5'

Si usa una trifosfatasi, poi si aggiunge la guanilina a opera della omonima transferasi, e infine viene aggiunto il metile al 7'. In questo momento viene introdotta una Alpha-32P-GP che marca il 5'. L'ATP è richiesto per l'RNAi? Se elimino l'ATP si vede che l'mRNA non scompare, vuol dire che se manca l'ATP non si ha RNA interferenze. Allora, visto che la sintesi proteica necessita di molto ATP, si pensa che l'RNAi agisca a livello di sintesi proteica. Allora si inibisce la sintesi proteica usando cloroanfenicolo, ansiomicina e puromicina, ma l'RNAi avviene comunque. Si fanno anche dei messaggeri, uno con e uno senza CAP, importante per la stabilità e per la sintesi proteica. Si vede che entrambi gli mRNA sono sensibili alla RNAi, e questo è conferma che la sintesi proteica non c'entra.

Che cosa succede al dsRNA mentre l'mRNA viene degradato?

I lisati embrionali vengono incubati con dsRNA in presenza o meno di mRNA. Se aggiungi il lisato compaiono delle bande, aggiungo lisato e mRNA compaiono le bande. Quindi è sufficiente aggiungere solo il lisato per osservare queste bande. E si vedono anche se marco solo senso o solo antisenso. Ciò significa che il lisato, indipendente dall'mRNA, viene degradato in frammenti di 21-23 bp. Quale che sia il dsRNA, ottengo gli stessi frammenti. Posso anche capire quanti frammenti si formano, usando delle molecole radioattive. Da ogni frammento di dsRNA dovrei avere 4/5 frammenti di 21-23 nt. Si vede come l'mRNA non sia fondamentale. Qualcosa deve succedere prima che l'RNAi possa funzionare.

L'ATP è importante per il processamento?

Vedono che anche in assenza di ATP il processamento avviene comunque, ma con minore efficienza. Si pensava che l'adenina deamminasi fosse importante nella denaturazione dell'RNA. Poiché l'Inosina non si appaierebbe con l'Uracile e l'RNA si degraderebbe. Quando il dsRNA c'è, si pensava che aumentasse l'inosina, ma non se ne vedono aumenti statisticamente significativi. Si vede come, in qualunque modo, l'antisenso, destabilizzi l'mRNA, ma in una quantità molto minore rispetto al dsRNA. Quindi l'asRNA prenderebbe parte al processo di interferenza del dsRNA. Questo è importante perché ciò vuol dire che è l'asRNA che si appaierà all'mRNA per degradarlo.

Rifanno l'esperimento marcando l'mRNA solo al 5', per capire come il dsRNA degradi l'mRNA. Incubano l'mRNA marcato al 5' e poi 3 diversi dsRNA. Si vede che in assenza di dsRNA, l'mRNA resti intatto. Se invece aggiungo separatamente uno dei 3, si formano tutta una serie di bande. Se vedo le bande, vuol dire che è incluso anche il 5'. Il frammento più piccolo corrisponde alla distanza tra CAP-5' e l'inizio del punto di appaiamento del dsRNA e mRNA. Quindi l'mRNA non è tagliato casualmente. Ho delle bande discrete, quindi, ho dei tagli a intervalli specifici. Quindi dopo vengono mappati i siti di taglio. I tagli si ripetono ogni 21-23 nt. Però ci sono delle eccezioni, avviene in corrispondenza di una serie di uridine, così anche come 14/16 dei siti di taglio.

Conclusioni

• Il dsRNA viene processato dall'estratto proteico prima di agire sull'mRNA
• Il processamento porta a frammenti di 21-23 nt
• Ci sarebbe una RNA elicasi ATP dipendente che svolgerebbe il dsRNA
• Ci sarebbero delle nucleasi associate all'asRNA che ne faciliterebbero la sua azione

"RNA is mediated by 21 and 22-nt RNAs"

Qui viene confermato la funzione dei 21-23 nt, mentre in quella precedente si mostra solo una possibile relazione! In altri laboratori si vede che questi frammenti si formano in Drosophyla, ma anche in C. Elegans e nelle piante. I filamenti di RNAas guiderebbero l'RNAi sull'mRNA target.

Come si può dimostrarlo? Uso direttamente i 21nimeri sull'mRNA e vedo se esso venga degradato. Ci si chiede se l'esistenza di dsRNA più o meno efficienti come interferenza, dipende dalla loro capacità di essere processati in 21nimeri.

Si fa un saggio di RNAi in vitro, però si chiama traslation assay. Fanno un'incubazione con mRNA e fanno un saggio di luciferasi dual: ossia rappresentano l'attività delle luciferasi come rapporto tra due luciferasi; una viene degradata e l'altra no (è un controllo interno).

Perché misurare allora in dual? A che serve un controllo interno?

Per normalizzare. Per, ossia, andare a ridurre l'errore sperimentale, la variabilità. Si usa come secondo controllo un dsRNA di 504 nt che annulla completamente l'attività della luciferina e si confronta con l'attività inibitoria dei frammenti via via più piccoli. Si vede che via via che diventano più piccoli, hanno una capacità minore di ridurre la traduzione di luciferina ed è indipendente dalle posizioni.

Dopo di che si decide di fare un saggio di processamento dei vari dsRNA con dimensioni via via diverse: 511, 111, 52, 39 e 29. L'unico che ha un processamento molto lento e quindi ha un'interferenza molto ridotta è il 29. Quindi c'è una correlazione tra capacità di interferenza e capacità di essere processato velocemente.

Anche qui vengono mappati i vari siti di taglio sull'mRNA. Sia i asRNA e l'ssRNA vengono a essere mappati a livello dei siti di taglio. Il filamento senso è tagliato due volte e una volta quello antisenso. I primi siti di entrambi sono 10 nt più giù.