Riassunto sulla replicazione del DNA

Replicazione del DNA

A ogni divisione cellulare, l'informazione genetica contenuta nel DNA deve essere duplicata e copiata con la massima fedeltà possibile per trasmettere alle cellule figlie lo stesso patrimonio genetico della cellula madre. Ogni variazione nella sequenza di nucleotidi genera mutazioni. Sono cambiamenti necessari, in quanto il loro accumularsi negli anni è stato alla base del processo evolutivo. Le mutazioni però possono anche essere dannose e un tasso di mutazione troppo elevato può essere pericoloso. È quindi importante che la replicazione del materiale genetico, cioè del DNA, avvenga nel modo più accurato possibile limitando l'insorgenza di mutazioni nel processo replicativo.

Un filamento di DNA non è altro che un polimero di nucleotidi, o polinucleotide. Una volta che si è formato un polimero, può influenzare la formazione di altri, in quanto i polinucleotidi possono fare da stampo in reazioni di polimerizzazione.

Replicazione semiconservativa del DNA

Nella struttura del DNA determinata da Watson e Crick, la complementarietà delle basi azotate nei due filamenti della doppia elica suggerì loro che ciascun filamento potesse agire come stampo per la sintesi di un filamento di neosintesi complementare al filamento parentale: tale ipotesi fu definita replicazione semiconservativa e prevedeva che i due filamenti parentali si separassero durante il processo replicativo.

Un altro possibile meccanismo prevedeva che i due filamenti della doppia elica parentale rimanessero appaiati e, in qualche modo, l'intera doppia elica potesse servire da stampo durante il processo replicativo dando origine a una molecola figlia di neosintesi uguale all'originale. Questa ipotesi si chiamava replicazione conservativa. Un terzo meccanismo, anche se apparve subito improbabile, ipotizzava una replicazione di tipo dispersivo: durante la replicazione, il DNA verrebbe frammentato e nelle due molecole figlie finirebbero per coesistere tratti di DNA parentali insieme a segmenti di DNA neosintetizzato.

Esperimento di Meselson e Stahl

Il risultato ottenuto da questo esperimento è stato possibile grazie alle nuove tecnologie sviluppate in quel tempo. Si scoprì infatti che il DNA poteva essere marcato e seguito sperimentalmente introducendo nella doppia elica degli isotopi pesanti dell'azoto, un atomo presente nelle basi puriniche e pirimidiniche del DNA. Ciò si può fare facendo crescere dei batteri in un terreno di coltura a cui sono aggiunti dei sali di ammonio che contengano l'isotopo pesante dell'azoto ¹⁵N al posto del normale ¹⁴N.

Molecole di DNA che contengono ¹⁵N hanno una densità maggiore e, dopo centrifugazione all'equilibrio in soluzioni concentrate di cloruro di cesio, si troveranno verso il fondo della provetta da centrifugazione, proprio perché hanno densità più elevata. Per capire dove si trova il DNA in provetta basta bucarla con un ago e raccogliere goccia a goccia il contenuto della provetta in diverse frazioni separate. Il DNA assorbe luce nell'ultravioletto a 260 nm e quindi, analizzando ciascuna frazione con uno spettrofotometro, si può determinare in quali frazioni si trova il DNA. Se la quantità di DNA è abbondante, proprio perché assorbe la luce UV a 260 nm, si può direttamente identificare dove si trova il DNA nella provetta illuminando la stessa con una lampada che emette luce UV.

Meselson e Stahl hanno affrontato il problema utilizzando l'Escherichia coli: cellule di E. coli sono state fatte duplicare per molte generazioni in un terreno contenente sali pesanti dell'azoto, affinché tutte le cellule avessero molecole di DNA contenenti ¹⁵N. A questo punto le cellule sono state raccolte tramite centrifugazione, lavate per togliere tracce di terreno e diluite in un terreno contenente sali d'ammonio con l'isotopo leggero ¹⁴N e fatte crescere in tali condizioni per 2 generazioni. L'ipotesi di Meselson e Stahl era che, se fosse stata vera l'ipotesi semiconservativa, dopo una generazione le cellule di E. coli che avevano replicato il loro DNA avrebbero dovuto avere molecole di DNA contenente un filamento parentale marcato con ¹⁵N e uno neosintetizzato marcato con ¹⁴N. Tutte le molecole dovevano quindi avere una densità intermedia. Alla seconda generazione, metà del DNA doveva essere a densità intermedia e metà a densità leggera. Al contrario, se fosse risultata vera l'ipotesi conservativa, nella prima generazione metà del DNA doveva essere pesante e metà leggero.

Modello del replicone

Dopo la scoperta della struttura del DNA e della replicazione semiconservativa, sorsero tre domande fondamentali negli scienziati:

• L'inizio della replicazione del DNA avviene a caso o parte da specifiche sequenze?
• Quali sono le proteine che realizzano il processo replicativo e come si assembla l'intera macchina proteica coinvolta in questo processo?
• Come si integra la replicazione del DNA con il meccanismo cellulare, visto che ogni cellula figlia deve ereditare lo stesso patrimonio genetico contenuto nella cellula madre?

Tali quesiti furono affrontati da Jacob, Brenner e Cuzin in un famoso articolo del 1963, in cui proposero il modello del replicone. Tale modello postula che l'inizio della replicazione è controllato da sequenze specifiche in cis sul DNA (replicatori). Tali sequenze determinano dove inizia la replicazione del DNA interagendo con specifiche proteine (iniziatori) che agiscono in trans.

Il modello del replicone fu ispirato dai dati ottenuti da John Cairns, che analizzò la geometria del cromosoma di E. coli durante la replicazione mediante autoradiografia. E. coli ha una sola molecola di DNA circolare molto grande, e può essere resa radioattiva facendo crescere le cellule batteriche in un terreno di coltura che contiene [³H]-timidina che viene incorporata nel DNA. Le cellule sono poi lisate su un vetrino da microscopio su cui viene stesa un'emulsione fotosensibile. La radioattività emessa dal trizio produce un'immagine del cromosoma visibile al microscopio ottico.

Il cromosoma di E. coli in replicazione mostra tre parti: a, b e c (guarda figura). La grande ansa a presenta una densità di granuli radioattivi sulla lastra fotografica circa doppia di quella osservabile nelle anse b e c. Nell'esperimento fatto, cellule di E. coli cresciute in terreno non radioattivo sono state fatte replicare per una generazione interna e parte di una seconda in presenza di timidina triziata. La porzione di DNA che ha replicato una volta sola in presenza di H³ timidina (b e c) ha solo un filamento marcato e uno non marcato. Il DNA che ha replicato due volte in presenza di H³ timidina possiede entrambi i filamenti marcati. Come ci si aspettava, le porzioni del cromosoma che entrambi i filamenti sono stati sintetizzati in presenza di timidina radioattiva (a) hanno una densità di grani doppia rispetto alle porzioni in cui uno solo dei filamenti è stato sintetizzato in presenza di H³ timidina. Questo risultato conferma anche che la replicazione di E. coli avviene in modo semiconservativo.

Il punto di inizio della replicazione è chiamato origine di replicazione: per una molecola di DNA circolare, la replicazione può procedere bidirezionalmente originando delle "bolle di replicazione" sempre più grandi. La replicazione bidirezionale a partire da specifiche origini è il meccanismo più comunemente usato in procarioti ed eucarioti anche se in alcuni casi può procedere unidirezionalmente. Con l'autoradiografia si può anche vedere se su un'unica molecola di DNA ci sono più origini di replicazione: molte origini sono utilizzate per replicare le lunghe molecole di DNA lineari presenti negli eucarioti. L'autoradiografia fa anche vedere se una bolla di replicazione si estende in una o entrambe le direzioni.

Identificazione delle origini di replicazione

Un'origine di replicazione corrisponde a una particolare sequenza di DNA da cui parte il processo replicativo, che procede soprattutto bidirezionalmente originando due forcelle di replicazione. Molecole di DNA semplici, come quelle di plasmidi, batteriofagi e virus hanno una singola origine di replicazione per molecola di DNA. La presenza di un'origine in questi elementi è importante perché batteriofagi e virus siano in grado di replicarsi in modo autonomo.

Origine di replicazione in E. coli: il cromosoma di E. coli viene replicato utilizzando una singola origine, chiamata oriC, che è stata identificata con varie strategie. Una di queste è stata sviluppata dopo lo sviluppo di tecniche per costruire molecole di DNA ricombinanti. Si è partiti da un tipico plasmide di E. coli contenente un gene che conferisce resistenza all'ampicillina e, mediante il taglio con enzima di restrizione, è stata eliminata la porzione di plasmide contenente l'origine di replicazione. Tale plasmide era incapace di replicarsi in E. coli, ma è stato usato per fare una banca di DNA di E. coli. L'ipotesi di lavoro era che frammenti di DNA di E. coli contenenti OriC potessero riconferire al plasmide difettivo la capacità di replicarsi e, alla cellula che lo ospita, la possibilità di crescere in un terreno con ampicillina.

Si è visto anche che i plasmidi contenenti oriC richiedono le stesse proteine necessarie per la replicazione del DNA di E. coli, suggerendo che potevano essere utilizzati come modelli corretti per lo studio funzionale dell'origine di replicazione di un batterio. Una volta isolato un frammento di DNA contenente oriC si è provveduto ad accorciarlo sempre più per vedere quale fosse la più corta sequenza di DNA di E. coli in grado di funzionare come origine. L'origine "minima" di E. coli è piccola, solo 245 pb. È una regione più ricca in A-T e il suo sequenziamento ha permesso di vedere che contiene 4 ripetizioni di 9 pb e 3 di 13 pb molto simili tra loro. La particolarità di essere ricche in A-T è una caratteristica comune alle origini di replicazione, ed è legata al fatto che un'origine di replicazione, per funzionare, deve potersi aprire ed è necessaria meno energia per denaturare localmente una regione di DNA ricca in A e T piuttosto che in C e G.

Quando una regione di DNA svolge una funzione specifica, e in essa ci sono corte sequenze (chiamate box) con composizione simile e/o ripetute più volte, è possibile ipotizzare che queste sequenze possano servire come un segnale di riconoscimento. Infatti le corte sequenze ripetute in oriC vengono riconosciute da proteine coinvolte nelle fasi iniziali della replicazione di DNA di E. coli. Quindi le caratteristiche generali delle origini sono che sono sempre ricche in A-T e contengono sequenze riconosciute da proteine che agiscono come iniziatori della replicazione. La differenza principale rispetto alla replicazione del cromosoma di E. coli è che alcune di queste molecole di DNA vengono replicate unidirezionalmente o, almeno, in modo asimmetrico, per cui le due forcelle di replicazione procedono in modo asincrono.

Origini di replicazione negli eucarioti

L'esistenza delle origini di replicazione negli eucarioti ha dato vita a molti dibattiti. Infatti, nei primi stadi dello sviluppo embrionale della Drosophila o di Xenopus, non sembrano esistere siti specifici d'inizio della replicazione del DNA, ma la sintesi del DNA parte da sequenze casuali. Inoltre, se viene iniettato DNA eterologo (esempio DNA di un batteriofago) in un oocita di Xenopus, il DNA eterologo viene replicato indicando l'assenza di una specie-specificità della replicazione di DNA nelle cellule embrionali.

Nelle prime divisioni dello zigote la necessità principale sembra quella di replicare il DNA il più rapidamente possibile concludendo velocemente la divisione cellulare. Solo dopo lo stadio di blastula la divisione rallenta e la replicazione non parte più a caso ma da origini specifiche; la causa di ciò non è ancora chiarita. Ciò che rimane certo, comunque, è che in tutti i cromosomi degli eucarioti esistono numerose origini di replicazione, ma non tutte le sequenze che potenzialmente possono agire come origini di replicazione vengono utilizzate a ogni ciclo di divisione cellulare.

L'esistenza di più origini di replicazione negli eucarioti è stata per la prima volta dimostrata da Joel Humberman e Arthur Riggs, mediante esperimenti di autoradiografia ma visibile anche con microscopia elettronica. L'osservazione di "bolle" di replicazione di dimensioni diverse indica due caratteristiche fondamentali delle origini dei cromosomi degli eucarioti:

• L'accensione delle origini non è simultanea, ma ci sono regioni "early" (precoci) che vengono accese presto durante la replicazione del DNA (fase S), mentre altre origini "late" (tardive) vengono attivate a tempi successivi.
• Le forcelle di replicazione che avanzano in direzioni opposte sul cromosoma possono fondersi tra loro.

Ogni origine di replicazione individua un possibile "replicone", ma non tutte le origini di replicazione sono necessariamente utilizzate durante la replicazione dei genomi degli eucarioti. Sorprendentemente, il replicone più grande è quello di E. coli: dato che nel suo genoma ha una sola origine di replicazione, la dimensione del replicone di E. coli coincide con l'intero genoma.

Questo fa sorgere il quesito di come una molecola di 4,2 Mpb possa replicarsi nel breve tempo (circa 20 minuti) richiesto per la divisione di una cellula di E. coli. La risposta risiede nella velocità del processo replicativo, maggiore nei procarioti. In E. coli la forcella si estende alla velocità di 50000 pb/minuto, mentre negli eucarioti questa velocità è molto variabile. Dal lievito ai mammiferi il numero delle origini di replicazione per genoma è compreso tra alcune centinaia (lievito) e 10-30000 (mammiferi) e questa differenza è legata alle diverse dimensioni del genoma. Nel corso dell'evoluzione, il passaggio da organismi con una sola origine di replicazione (procarioti) a organismi con più origini di replicazione (eucarioti) ha rappresentato una transizione importante ed essenziale per l'evoluzione di genomi di grandi dimensioni.

ARS del lievito Saccharomyces cerevisiae

Questo è un lievito prediletto per le ricerche in biologia molecolare. Per quanto riguarda la replicazione del DNA, il lievito ha un genoma solo 2,5 volte più grande di quello di E. coli, diviso in 16 cromosomi lineari, ognuno con diverse origini di replicazione. Le sue origini di replicazione sono state individuate con una logica simile a quella descritta per l'identificazione di oriC.

Un plasmide che normalmente si propaga in cellule di E. coli non è in grado di replicarsi autonomamente se introdotto in cellule di S. cerevisiae; questo è facilmente capibile poiché S. cerevisiae utilizza un corredo di proteine specifiche per il riconoscimento delle sue proprie origini. Si può tentare di costruire una banca di DNA di lievito in un plasmide batterico e poi vedere se specifici frammenti di DNA di lievito, introdotti nel plasmide con tecniche di DNA ricombinante, lo rendano capace di replicarsi una volta introdotto all'interno di una cellula di lievito. Questa tecnica si applica facilmente perché si possono utilizzare cellule di lievito mutanti che richiedono la presenza e replicazione del plasmide per crescere su uno specifico terreno selettivo.

Se un frammento di DNA di lievito contiene un'origine di replicazione lo si può individuare nella banca di DNA perché rende il plasmide capace di replicarsi autonomamente: per questo motivo le origini del lievito sono state chiamate ARS (Autonomously Replicating Sequences). Tutte le ARS di lievito contengono almeno una copia di una ARS Consensus Sequence (ACS, chiamata anche dominio A), di 11 pb (T/A)TTTA(T/C)(G/A)TTT(T/A). Singole mutazioni nell'ACS aboliscono la funzione di una ARS. L'ACS è fiancheggiata da sequenze non particolarmente conservate ma sono comunque segmenti di DNA che, come l'ACS, sono ricchi in A e T.

Si pensa, quindi, che siano regioni di DNA che svolgano una funzione essenziale nella replicazione del DNA.